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环孢霉素和布喹那抗黄病毒活性和机制研究认领

作者：

青敏

学位授予单位：

中国科学院大学

摘要：

黄病毒是由节肢动物传播的重要的人类致病原，能够导致人患病甚至引起死亡，但目前还没有一种有效的治疗性药物，因此开发高效的抗黄病毒感染的药物具有重要意义。环孢霉素(Cyclosporine;Cs)和布喹那(Brequinar;BQR)分别通过抑制细胞内具有肽基脯氨酰顺反异构酶(peptidyl-prolyl isomerases;PPlase)活性的亲环素蛋白(cyclophilins;CyPs)和嘧啶合成所需的二氢乳清酸脱氢酶(dihydroorotate dehydrogenase;DHODH)活性，从而分别抑制丙型肝炎病毒(HCV)和部分黄病毒成员的感染。　　本文在研究Cs和BQR抗黄病毒的活性的基础上，对其抗黄病毒机制进行了研究，表明了宿主蛋白CyPs和DHODH可作为抗黄病毒药物的潜在靶点。在对Cs的研究中，我们发现Cs的靶点蛋白CyPs对黄病毒的复制起到了重要的作用。一方面，在敲除CyPs的细胞中黄病毒的复制水平低，这种因为CyPA敲除所导致的黄病毒低水平复制能通过表达外源野生型CyPA得到回升，而无PPlase活性的CyPA突变型的外源表达并不影响黄病毒的复制，表明CyPA的PPIase活性对于黄病毒的复制起到了关键性的作用;另一方面，CyPA能够和西尼罗病毒的基因组RNA以及病毒的非结构蛋白NS5相互作用，暗示了CyPA存在于西尼罗病毒的复制复合体中。病毒抑制、时相加样法和瞬时复制子实验结果表明，Cs作为CyPA活性抑制剂也能够明显抑制黄病毒的复制;生化分析证明，Cs能直接阻断CyPA和西尼罗病毒NS5蛋白之间的相互作用，揭示了Cs通过阻断WNV复制复合体的形成来抑制病毒RNA合成的抗病毒作用机理。BQR作为DHODH酶活抑制剂具有广泛的抗病毒活性。它不仅抑制黄病毒属成员(登革病毒，西尼罗病毒，黄热病毒以及波瓦生病毒)同时也抑制甲病毒属的西方马脑炎病毒(单股正链RNA病毒)和棒状病毒属的水泡性口炎病毒(负链RNA病毒)。我们利用登革2型病毒(dengue virus serotype2;DENV-2)作为研究模型，发现BQR能抑制病毒的RNA合成，而同时外源的嘧啶核苷能够特异性回复BQR对DENV-2的抑制效果。通过持续加药筛选获得了BQR耐药性病毒株，测序分析表明，耐药病毒株有两个氨基酸发生突变：一个突变(M260V)处在病毒的结构蛋白包膜蛋白的结构域Ⅱ的螺旋结构上，另一个突变(E802Q)在非结构蛋白NS5的聚合酶结构域的激发环上。进一步的分析表明，耐药毒株是通过NS5的突变增强聚合酶活性从而产生抗药性，包膜蛋白的突变虽然降低了病毒粒子包装和释放的效率，却在包装和释放阶段对BQR的抑制作用变得不敏感。这些结果暗示了(i) BQR能够通过消耗细胞内的胞嘧啶来抑制DENV RNA的合成;(ii)这个化合物可能通过抑制病毒粒子的包装和释放来产生抗病毒活性。以上两方面的研究结果证明CyPs和DHODH这两类蛋白可成为抗黄病毒复制的潜在靶点。为了高通量筛选出更多有效的抗黄病毒的药物，我们开发了一种崭新的高产量制备DENV-1假病毒(virus-like particle;VLP)的方法，确定了外源表达弗林蛋白酶对DENV-1 VLP的感染性起增强作用，优化了VLP感染条件，建立了以DENV-1 VLP为模型的药物高通量筛选体系。该筛选系统可以用于登革病毒的进入，翻译和复制抑制剂的筛选。384孔板中VLP感染体系应用时信号的稳定和灵敏性进一步证明了DENV-1 VLP感染系统可以快速、高通量进行登革病毒药物的高通量筛选。该筛选系统的建立将会促进抗登革病毒药物的研究和开发。

摘要译文

关键词：

抗病毒药; 环孢霉素; 生化药理; 亲环素蛋白

学位年度：

2011

学位类型：

博士

学科专业：

微生物学

导师：

袁志明

中图分类号：

R978.7[抗病毒药物];R963[生化药理学]

学科分类号：

100603[中西医结合药学];100707[临床药学];100109[医学药理学];100706[药理学]