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海洋放线菌ACMA006抗肿瘤活性成分的分离纯化及放线菌素D抗肝癌作用研究认领

作者：

曹雪

学位授予单位：

东南大学

摘要：

长期以来，恶性肿瘤对人类的健康构成了严重威胁。药物治疗作为肿瘤治疗的主要手段，一直受到人们的重视。微生物是重要的天然产物资源。微生物品种极其多样，其代谢物的化学复杂性和多样性是研制新药取之不尽的宝库。近年来，随着研究热点的转移，新药的研究开发已突破了陆生资源的束缚，拓展到了生态和物种更为复杂多样的海洋。海洋微生物生存环境特殊，它们具有一些独特的代谢途径和遗传背景，可能产生特殊的次生代谢产物，其化学结构类型多样、活性显著，是新活性先导化合物的重要来源。近年从海洋来源的微生物代谢产物中发现了许多结构新颖的活性物质，引起广泛的关注。本实验小组从连云港海域分离所得的96株海洋微生物菌株中筛选出了具有抗肿瘤活性的放线菌ACMA006，并对其进行了分类鉴定，确定海洋放线菌ACMA006属于链霉菌属，是卡伍尔链霉菌华盛顿亚种（S．cavourensis subsp．Washingtonensis）的一个新的分离菌株。其发酵液对多种肿瘤细胞株都具有很强的细胞毒性，能诱导肿瘤细胞凋亡;有良好的抗肿瘤活性。本研究以海洋放线菌ACMA006为实验材料，对其发酵产物中的抗肿瘤活性成分进行分离纯化，从中获得活性单体化合物，并利用核磁共振等波谱分析技术鉴定其结构。在此基础上，以肝癌HepG2细胞为受试细胞株，考察单体化合物体外抗肝癌活性，并进一步探讨其对肝癌HepG2细胞的作用机制，为活性化合物的临床提供基础。目的： 1、对海洋放线菌ACMA006的发酵产物进行分离纯化，获得抗肿瘤活性成分，并进一步鉴定其结构。 2、对分离得到的单体化合物进行体外抗肝癌活性研究，并探讨其抗肝癌作用机制，为活性化合物的进一步临床应用提供基础。方法： 1、建立发酵提取工艺：海洋放线菌ACMA006经大规模发酵后，发酵液采用溶剂萃取法提取其中的抗肿瘤活性成分，并利用硅胶柱层析、制备薄层及HPLC等方法对萃取物进行分离得到单体化合物。 2、利用红外光谱、质谱、核磁共振1H-HMR谱和13C-NMR谱等波谱数据对单体化合物的结构进行解析和鉴定。 3、采用MTT法检测不同浓度的单体化合物作用不同时间后对HepG2细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪检测不同浓度的单体化合物作用不同时间后对HepG2细胞周期及细胞凋亡率的影响;并在荧光显微镜下观察细胞凋亡的形态变化。 4、采用Western blot方法检测单体化合物作用不同时间后，对肿瘤相关蛋白Survivin及凋亡相关蛋白酶caspase-3表达的调控作用。结果： 1、建立发酵提取工艺，获得单体化合物。海洋放线菌ACMA006的发酵液以不同极性的溶剂萃取后，经体外细胞毒活性检测，发现乙酸乙酯相的活性和得率较高，因此采用乙酸乙酯作为萃取溶剂，在后续实验中对乙酸乙酯相进行分离和纯化。萃取后的粗提物经硅胶柱层析、薄层层析和高效液相色谱（HPLC）分离，最终得到化合物A和化合物B。HPLC分析检测其纯度分别为93．1％和94．0％。 2、对分离纯化获得的单体化合物进行结构解析。化合物B在13C NMR谱中共显示62个碳信号，其中16个组成actinocin生色团，还有23个组成每两个相同的cyclopentapeptides。根据1H-HMR谱和13C NMR谱推测该化合物结构分为两部分：一为肽类结构，另一部分为共轭双键体系，肽类结构可能与共轭双键体系相连。由1H-HMR谱和13C NMR谱可看到该化合物肽类部分的化学位移有两组数据接近，推测可能为两个对称的肽结构，连接在不对称的基团上，化学位移接近但不完全一致。化合物B的13C NMR谱信号与文献报道的放线菌素D的信号相同，从而确定化合物B即为放线菌素D，其分子式为C62H86N12O16。化合物A的结构与化合物B相似，可能为放线菌素D的衍生物，具体结构还需进一步鉴定。 3、纯化获得的活性成分——放线菌素D对于肝癌细胞HepG2具有明显的增殖抑制作用，且呈明显的时间依赖性及剂量依赖性。流式细胞仪分析显示，同一作用时间下，随着药物浓度的增加，S期细胞的比例明显增多，G1期细胞的比例明显下降，呈浓度依赖性。同一作用浓度下，48h组细胞S期的比例较24h组均有所升高，但仅当放线菌素D的作用浓度为50ng/mL时，24h组和48h组之间存在差异，而1ng/mL和10ng/mL浓度下24h组和48h组之间的差异无显著性。此外，10和50ng/mL的放线菌素D处理HepG2细胞48小时后，在G0/G1期前出现一个凋亡峰，表明放线菌素D可通过诱导细胞凋亡而杀死肿瘤细胞。用50ng/mL的放线菌素D处理后，荧光显微镜下可见典型的凋亡细胞的形态学特征，部分细胞的核收缩、碎裂，形成凋亡小体：并且，48h组HepG2细胞凋亡的程度和凋亡细胞比例较24h组更明显。 4、Western blot实验结果表明，用放线菌素D处理HepG2细胞24、48、72h后发现：高浓度（50ng/mL）和低浓度（1μg/mL）的放线菌素D均能下调Survivin蛋白的表达水平，且存在一定的时间和剂量依赖性;用同样浓度的放线菌素D处理后pro-caspase-3蛋白的表达也均有所下降，随着放线菌素D作用时间的延长，pro-caspase-3蛋白呈时间依赖性下调趋势，且高浓度组对pro-caspase-3蛋白的下调作用较低浓度组更明显。说明放线菌素D能通过促进pro-caspase-3的裂解，激活caspase-3蛋白的表达水平来诱导肿瘤细胞凋亡。上述研究结果表明，放线菌素D诱导人肝癌细胞HepG2细胞凋亡可能是通过下调Survivin的表达，解除原先对caspase-3活性的抑制，进而激活细胞凋亡程序诱导癌细胞凋亡。结论： 1、从海洋放线菌ACMA006的发酵液中分离得到2种抗肿瘤活性化合物，HPLC分析检测化合物A和化合物B的纯度分别为93．1％和94．0％。 2、化合物B为放线菌素D，化合物A可能为放线菌素D的衍生物。 3、放线菌素D可显著抑制肝癌HepG2细胞增殖，并诱导HepG2细胞凋亡。其作用机制可能是通过下调Survivin蛋白的表达水平，并激活caspase-3，将HepG2细胞阻滞在S期来诱导肝癌细胞凋亡。

摘要译文

关键词：

海洋放线菌; 分离纯化; 结构鉴定; 抗肿瘤活性; 细胞凋亡; 药物治疗

学位年度：

2009

学位类型：

硕士

学科专业：

免疫学

导师：

杨瑞丽

中图分类号：

R286.91;R915[药物生物学]

学科分类号：

070306[化学生物学];100603[中西医结合药学];100705[微生物与生物技术药物学]

D O I：

10.7666/d.y1580527