青霉素酰化酶催化合成光学纯氨基酸的研究-文献详情-维普官网

文献检索

任意字段

文献信息

任意字段
主题词
篇关摘
篇名
关键词
摘要
作者
第一作者
作者单位
刊名
中图分类号
学科分类号
DOI
基金

智能检索

高级检索

检索历史

青霉素酰化酶催化合成光学纯氨基酸的研究认领

作者：

刘书来

学位授予单位：

华东理工大学

摘要：

氨基酸在人体及动物的生命活动中起着举足轻重的作用。从营养学的观点来看，只有L-氨基酸才能为机体直接利用；而在医药工业中，由于D-氨基酸难以被细菌降解而不致产生抗药性，使得其应用也日益广泛。目前，氨基酸的对映体主要通过化学合成的手段获得，但在D-氨基酸的合成上成功的例子并不多。由于对映选择性好、收率高、反应条件温和、步骤简便等，酶法合成已成为制备手性氨基酸的有效手段之一。本论文利用来源于Kluyveracitrophila的青霉素G酰化酶，选择性地水解氨基酸消旋体的苯乙酰衍生物，可以实现L-氨基酸和D-氨基酸的拆分分离。在第2章中重点研究了碳源、氮源、诱导温度和诱导物IPTG的浓度对重组大肠杆菌BL21(DE3)[pET24a]的生长情况和青霉素G酰化酶的发酵表达的影响，确定了最适的发酵培养基和培养条件。通过在发酵罐中恒溶氧的批式发酵，菌体浓度达到15.5，酶活为15600U/L。第3章中通过青霉素G酰化酶的硫酸铵分级沉淀，再经过DEAESepharoseFastFlow阴离子交换层析，优化了酶的纯化条件，提高了酶的比活。将纯化的青霉素G酰化酶固定化于环氧载体Amberzyme(R)上，并考察了该固定化酶和游离酶的最适pH、最适温度、温度稳定性和pH稳定性。结果表明游离酶的最适水解pH和最适温度分别为pH7.5和50℃，pH的使用范围为6.0-9.0。酶的固定化使其最适水解温度提高到55℃，同时酶的热稳定性和pH稳定性也相应提高。本文的第4章研究了青霉素G酰化酶催化DL-叔亮氨酸的拆分过程，考察了反应温度、pH、酶浓度等对酶促水解N-苯乙酰-D-叔亮氨酸的影响。酶在比较宽的pH范围和温度范围内具有很高的对映选择性，酶量的加大可以进一步提高产物的纯度。通过对酶法拆分过程的总体分析，获得了光学纯度很高的产物。对酶水解动力学的研究也证实了在低底物浓度时的水解反应符合米氏方程。在水解过程中，存在高底物浓度的抑制作用、苯乙酸的竞争性抑制作用和叔亮氨酸的非竞争性抑制作用。第5章通过对多种α-氨基酸的苯乙酰衍生物的酶促水解反应进行了研究，结果表明青霉素G酰化酶优先选择L-型氨基酸的苯乙酰衍生物，并且水解速度的快慢与氨基酸的侧链R的结构有关。测定了酶对L-型氨基酸的苯乙酰衍生物的Km，并以kcat/Km来描述青霉素G酰化酶对底物选择性的差别。氨基酸的拆分效果采用ee和E值表示，E值大于100时可以用来拆分氨基酸并获得光学纯的氨基酸。这样，通过酶法对氨基酸消旋体的拆分，可以得到纯度较高的谷氨酸、叔亮氨酸、苯甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸的对映体。(kcat/Km)L/(kcat/Km)D被用来说明酶对L-型和D-型底物立体选择性的差别。第6章以DL-叔亮氨酸的拆分为例，考察了有机共溶剂对氨基酸拆分的影响，结果发现有机共溶剂的浓度对酶反应的速度影响很大。重点研究了在2％(v/v)有机共溶剂浓度时不同溶剂对酶反应的作用，并由此建立了反应速度与有机共溶剂的疏水性参数logP和介电常数ε之间的关系。有机共溶剂对酶的稳定性和对映选择性的影响也是选择溶剂的一个重要衡量标准。高logP和低ε的有机共溶剂(如甘油和乙二醇)是酶反应首选的有机共溶剂。在第7章中研究了水-乙酸丁酯双相体系中叔亮氨酸的拆分情况。在偏酸性条件下，底物N-苯乙酰-DL-叔亮氨酸以及酶催化水解产生的产物苯乙酸主要分配在乙酸丁酯中，而另一种产物L-叔亮氨酸则保留在水相中。这样，在水解反应的同时底物逐渐地由有机相向水相转移，避免了高底物浓度对酶反应的抑制作用；产物苯乙酸被萃取到有机相中，从而减弱了苯乙酸的竞争性抑制作用；产物被萃取到有机相中改变了反应平衡，使得酶水解反应后L-叔亮氨酸的产率提高至近100％，回收的D-叔亮氨酸的纯度也相应提高至99.5％。

摘要译文

关键词：

氨基酸; 青霉素G酰化酶; 拆分分离; 催化合成

学位年度：

2005

学位类型：

博士

学科专业：

生物化工

导师：

魏东芝

中图分类号：

TQ464.7[氨基酸、肽、蛋白质];R977.4[氨基酸及其衍生物]

学科分类号：

081702[化学工艺];083611[医药生物工程];100705[微生物与生物技术药物学];100603[中西医结合药学];100707[临床药学]