ATF4介导的线粒体未折叠蛋白反应在急性期癫痫大鼠海马神经损伤中的作用及机制-文献详情-维普官网

文献检索

任意字段

文献信息

任意字段
主题词
篇关摘
篇名
关键词
摘要
作者
第一作者
作者单位
刊名
中图分类号
学科分类号
DOI
基金

智能检索

高级检索

检索历史

ATF4介导的线粒体未折叠蛋白反应在急性期癫痫大鼠海马神经损伤中的作用及机制认领

作者：

盛汉卿

学位授予单位：

郑州大学

摘要：

目的：　　癫痫是一种常见的、以反复发作为特征的慢性神经系统疾病。癫痫发作极大的影响患者的生活质量，给人类健康带来严重威胁。迄今为止，癫痫依旧是一个全球性的社会问题和巨大的社会财政负担，全球有超过5000万人患有癫痫,其中大约30％的患者对现有药物治疗无效，因此寻找新的治疗方法和药物对于缓解癫痫患者的痛苦和提高生活质量具有重要意义。近年来，一些研究发现癫痫发作与线粒体功能障碍密切相关。癫痫发作引起细胞内钙离子浓度升高破坏线粒体膜，造成线粒体钙超载、ROS生成增加、同时ATP过度消耗加重线粒体功能障碍，线粒体内蛋白质稳态失调，严重时引起细胞凋亡，使细胞对痫性损伤更加敏感。　　线粒体未折叠蛋白反应(Mitochondrial unfolded protein response,mtUPR)是指在应激条件下，随着受损或错误折叠的蛋白质转运到线粒体并在线粒体内积累，激活的一种应激反应。mtUPR通过控制线粒体伴侣蛋白促进蛋白质折叠和防止聚集体形成，控制线粒体蛋白酶以减少受损或错误折叠蛋白质的积累，从而维持线粒体蛋白稳定。活化转录因子4(Activating transcription factor 4,ATF4),通过调节细胞内多种基因的表达来调节包括mtUPR在内的多种生物反应。近期研究表明，mtUPR在多种神经退行性疾病的发病过程中发挥重要作用，但目前为止，ATF4介导的mtUPR在癫痫神经损伤中的作用及机制仍然未知。　　本研究使用氯化锂-匹罗卡品（pilocarpine,PILO）诱导的大鼠急性颞叶癫痫模型，通过双侧海马立体定位注射转染慢病毒，干预大鼠ATF4表达，通过检测海马组织mtUPR相关的线粒体分子伴侣和蛋白酶水平，检测活性氧（Reactive oxygen species,ROS）和自噬、凋亡指标，探讨ATF4介导的mtUPR在急性期癫痫大鼠神经损伤中的作用及具体机制。　　方法：　　本研究将108只SPF级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠分为时间点组和慢病毒干预组，其中时间点组共48只大鼠，慢病毒干预组共60只大鼠。　　将时间点组中的48只8-9周龄SPF级雄性SD大鼠随机分为6组:对照组（con组）、3h组、8h组、24h组、3d组和7d组（每组n=8）,PILO癫痫造模后根据时间点取海马组织，然后采用Western blot（WB）法检测各组大鼠对应时间点mtUPR相关蛋白的表达。　　将慢病毒干预组中的60只6-7周龄SPF级雄性SD大鼠随机分为5组:对照组（CON组）、致痫组（AE组，PILO诱导）、阴性对照组（NC组，海马定向导入lenti-pGV+PILO诱导）、ATF4低表达组（Sh-ATF4组，海马定向导入lenti-ATF4-shRNA+PILO诱导）以及ATF4高表达组（Lv-ATF4组，海马定向导入lenti-ATF4+PILO诱导），每组12只大鼠。在注射麻醉后，大鼠固定于立体定向仪上，双侧海马定向导入慢病毒干预ATF4表达。14天后，通过腹腔注射法建立PILO诱导的大鼠急性颞叶癫痫模型，对照组注射等量生理盐水。根据时间点组检测出的mtUPR最强的时间点（24h）,处死大鼠并取海马组织，采用HE染色和TUNEL染色观察海马组织细胞形态和组织损伤情况。此外，还采用WB法检测各组大鼠ATF4、线粒体分子伴侣（HSP60）、线粒体蛋白酶（Lonp1、ClpP）、自噬相关蛋白（LC3-B、Beclin-1）及凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2）表达变化，采用免疫荧光染色观察各项指标的亚细胞定位，ROS染色检测氧化应激水平，探讨ATF4调控的mtUPR在癫痫神经损伤中的作用机制。　　结果：　　1.癫痫造模结果:本实验共用108只大鼠，其中88只进行氯化锂-PILO癫痫造模，其中造模成功的大鼠80只，造模失败8只，造模成功后死亡10只，死亡大鼠多在癫痫造模成功后第3-7天期间死亡（6只），大鼠多数在腹腔注射PILO后的0.5-1小时内达到四级或以上发作，平均潜伏期时长为30.89分钟，时间点组、AE组、NC组、Lv-ATF4组和Sh-ATF4组大鼠在造模过程中的行为学表现和发作时间无显著差异。　　2.急性期癫痫大鼠海马组织中的mtUPR:WB结果显示癫痫急性期大鼠各时间点海马组织蛋白中的线粒体未折叠蛋白反应增强，其中以24h组线粒体伴侣蛋白和蛋白酶表达最高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。　　3.慢病毒转染结果检测:海马组织冰冻切片显示海马各细胞层均转染上慢病毒自带的亮绿色荧光;WB检测结果显示:与CON组相比，AE组大鼠ATF4表达明显升高;与NC组相比，Sh-ATF4组ATF4表达降低，Lv-ATF4组ATF4表达升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）;AE组与NC组比较，两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。　　4.ATF4对急性期癫痫大鼠海马组织损伤的影响:HE染色结果显示与CON组相比，AE组和NC组CA1区神经细胞数量明显减少，细胞排列紊乱，出现较多异形、深染的细胞;与NC组相比，Sh-ATF4组海马CA1区的神经细胞数量进一步减少，异形细胞比例明显增多;与NC组相比，Lv-ATF4组海马CA1区的异形和深染的细胞数量明显减少。采用TUNEL法检测海马石蜡切片CA1区细胞凋亡，结果显示:与CON组相比，AE组凋亡神经细胞数量明显增加，与NC组相比，Sh-ATF4组大鼠海马CA1区凋亡神经细胞比例明显增加（P＜0.05）,Lv-ATF4组大鼠海马CA1区凋亡神经细胞比例减少（P＜0.05）;AE组与NC组比较，两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。　　5.ATF4对海马组织mtUPR相关蛋白的影响:WB检测结果显示与CON组相比，AE组大鼠线粒体分子伴侣HSP60、线粒体蛋白酶Lonp1、ClpP的蛋白表达明显升高;与NC组相比，Sh-ATF4组HSP60、Lonp1、ClpP的表达明显降低、Lv-ATF4组HSP60、Lonp1、ClpP的表达明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。AE组与NC组比较，两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。　　6.ATF4对急性期癫痫大鼠海马组织自噬的影响:WB结果显示，与CON组相比，AE组大鼠海马中的LC3B、Beclin-1表达增加;与NC组相比，Sh-ATF4组Beclin-1、LC3B明显增加，Lv-ATF4组Beclin-1、LC3-B表达减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）;AE组与NC组相比，两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。　　7.ATF4对急性期癫痫大鼠海马组织ROS染色的影响:海马组织冰冻切片ROS染色发现:与CON组相比，AE组海马CA1区ROS明显增加;与NC组相比，过表达ATF4组海马组织CA1区ROS明显降低，低表达ATF4组则增加,差异均有统计学意义（P＜0.05）;AE组与NC组比较，两组间无统计学意义（P＞0.05）。　　8.ATF4对急性期癫痫大鼠海马组织星形胶质细胞相关蛋白GFAP的影响:与CON组相比，AE组海马的CA1区GFAP荧光强度增加;与NC组相比，Sh-ATF4组CA1区的GFAP荧光强度明显增加，ATF4高表达GFAP荧光强度减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）;AE组与NC组比较，两组间无统计学意义（P＞0.05）。　　9.ATF4对急性期癫痫大鼠海马神经组织中凋亡相关蛋白的影响:WB结构显示与CON组相比，AE组凋亡相关蛋白Bax明显增加、抗凋亡蛋白Bcl-2明显减少;与NC组相比，Sh-ATF4组凋亡相关蛋白Bax明显增加、抗凋亡蛋白Bcl-2明显减少;Lv-ATF4组凋亡相关蛋白Bax明显减少、而抗凋亡蛋白Bcl-2增加;差异均有统计学意义（P＜0.05）;AE组与NC组比较，两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。海马组织石蜡切片Caspase9免疫荧光染色结果显示:与CON组相比，AE组海马CA1区的Caspase9荧光强度明显增强;与NC组相比,Sh-ATF4组海马CA1区的Caspase9荧光强度明显增强,ATF4高表达组海马CA1区Caspase9的荧光强度明显减弱;差异均有统计学意义（P＜0.05）,AE组与NC组比较，两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。　　结论：　　1.癫痫发作激活mtUPR,ATF4调控的mtUPR可能参与了癫痫的病理生理机制。　　2.在癫痫发作急性期，ATF4可能通过激活mtUPR,抑制海马组织星形胶质细胞增生，减少海马组织ROS生成，最终抑制自噬和凋亡途径，减少癫痫引起的神经损伤，发挥神经保护作用。

摘要译文

关键词：

急性期癫痫; 海马神经损伤; 活化转录因子4; 线粒体未折叠蛋白反应; 病理机制

学位年度：

2023

学位类型：

硕士

学科专业：

神经病学

导师：

连亚军

中图分类号：

R742.1[癫痫⑨];R741.02[神经病理学、病因学]

学科分类号：

100210[神经病学];071010[神经生物学];100219[临床病理学]