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奈拉替尼通过抑制MAPK/NF-κB信号通路的激活延缓骨关节炎进程的机制研究认领

作者：

邱健鑫

学位授予单位：

温州医科大学

摘要：

研究目的：　　骨关节炎(OA)是一种十分常见退行性疾病，表现为软骨和软骨下骨的逐渐被破坏。已有研究表明，通过抑制软骨细胞的降解和软骨下骨的流失，可以预防和治疗OA。目前OA的早期临床治疗策略主要集中在全身或局部应用非甾体抗炎药物(NSAIDs)来缓解疼痛和炎症。然而，NSAIDs不仅半衰期短，清除率快，需要频繁用药，而且长期用药会导致严重的不良反应，包括消化性溃疡、肾衰竭和出血等。关节置换术被认为是治疗晚期OA的有效方法，但手术的风险和昂贵的费用不容忽视。因此，寻找一个安全而有效的策略优化OA的治疗是有价值的。奈拉替尼(Neratinib)作为一种不可逆的泛HER酪氨酸激酶抑制剂，已被用于治疗HER2+癌症其是一种多激酶抑制剂，能抑制RIP3激酶的活性，以及由RIP3介导的相关下游通路的激活，包括MAPK和NF-κB信号通路，可能在OA的发展过程中起着重要作用。本研究旨在阐明奈拉替尼是否可以通过MAPK和NF-κB信号通路调控软骨、软骨下骨和破骨细胞从而发挥延缓骨关节炎的作用及其机制。　　研究方法：　　1.观察奈拉替尼对于软骨细胞、破骨细胞活力的影响：使用CCK-8来检测不同浓度奈拉替尼对软骨细胞和破骨细胞活力的影响。　　2.观察奈拉替尼对于软骨细胞周围基质代谢的影响：使用WesternBlot，qRT-PCR检测合成代谢与分解代谢的相关蛋白表达情况，使用高密度培养甲苯胺蓝染色观察奈拉替尼对软骨细胞周围基质的影响。　　3.观察奈拉替尼对模拟OA状态下破骨细胞形成的作用：使用RANKL诱导刺激小鼠骨髓源性巨噬细胞诱导破骨细胞分化，使用TRAP染色观察奈拉替尼对于破骨细胞形成和分化的影响。　　4.观察奈拉替尼对炎症诱发的OA中软骨细胞焦亡的作用：使用WB检测使用IL-1β作用后，观察奈拉替尼对NLRP3等焦亡蛋白的表达情况。　　5.观察奈拉替尼对于炎症状态下软骨细胞和破骨细胞中MAPK和NF-κB信号通路的调节作用：使用WesternBlot，qRT-PCR检测的MAPK和NF-κB信号通路相关蛋白表达情况，观察奈拉替尼对软骨细胞、破骨细胞MAPK和NF-κB信号通路的影响。　　6.观察奈拉替尼对于破骨相关基因表达的影响：使用qRT-PCR检测OA状态下小鼠骨髓源性破骨细胞中生长和分化相关基因的表达情况。　　7.观察奈拉替尼对内侧半月板失稳型骨关节炎小鼠的影响：采用手术切除小鼠内侧副韧带的方法建立DMM模型，并于奈拉替尼治疗8周后行组织学切片检测：包括HE、SO染色、Aggrecan免疫组化和TRAP染色等，评估奈拉替尼在体内的作用效果。　　研究结果：　　1.奈拉替尼对于软骨细胞、破骨细胞活力的影响：使用不同浓度梯度(从3.13到400nmol/L)的奈拉替尼孵育细胞24小时和48小时。结果在对ADTC5软骨细胞和破骨细胞无毒性的基础上，我们选择了三种浓度(3.13、6.25、12.5 nmol/L)的奈拉替尼进行后续实验。　　2.观察奈拉替尼对于软骨细胞周围基质代谢的影响：WB和高密度染色显示，与IL-1β组相比，奈拉替尼可促进合成代谢蛋白表达，并抑制分解代谢相关蛋白。　　3.观察奈拉替尼对模拟OA状态下破骨细胞形成的作用：使用TRAP染色，观察到形成的TRAP(+)破骨细胞总数以剂量依赖的方式减少。同时，在药物处理不同时间后的染色结果显示药物可能在早期阶段抑制破骨细胞的作用较强。　　4.观察奈拉替尼对炎症诱发的OA中软骨细胞焦亡的作用：用IL-1β处理时，ATDC5细胞的焦亡途径被激活，奈拉替尼处理抑制了炎症环境中软骨细胞的焦亡水平。　　5.观察奈拉替尼对于炎症状态下软骨细胞和破骨细胞中MAPK和NF-κB信号通路的调节作用：qRT-PCR和westernblot结果显示奈拉替尼以浓度依赖的方式有效抑制了IL-1β诱导的p-ERK、p-p38和p-JNK水平的升高和NF-κB信号通路的激活。　　6.观察奈拉替尼对于破骨相关基因表达的影响：PCR结果显示奈拉替尼抑制破骨细胞下游核转录因子c-Fos和NFATc1的作用以及其他破骨标志基因。　　7.观察奈拉替尼对内侧半月板失稳型骨关节炎小鼠的影响：奈拉替尼给药减轻了的关节面软骨的破坏和塌陷。此外，免疫组织化学染色显示，奈拉替尼可以改善小鼠Aggrecan表达，TRAP染色显示奈拉替尼减轻了OA小鼠模型中软骨下骨中破骨细胞的异常增殖。　　研究结论：　　奈拉替尼(Neratinib)作为一种具有抗炎和抗肿瘤特性的小分子化合物，对于IL-1β诱导的软骨细胞炎症和合成分解代谢紊乱，能够发挥有效的作用。本文通过研究奈拉替尼对ATDC5软骨细胞的影响实验，结果发现奈拉替尼通过抑制MAPK和NF-κB信号通路降低炎症。破骨细胞是OA软骨下骨重塑过程的关键参与者，我们还研究了奈拉替尼对破骨细胞成熟的影响。结果显示，奈拉替尼在体外能起到抗破骨细胞的作用，可以减少破骨细胞相关基因的表达，从而抑制RANKL诱导的破骨细胞生成，进一步的体内动物实验的结果支持了体外实验的结论。本研究提示奈拉替尼既能抑制内侧半月板损伤诱导的关节软骨降解破坏，又能抑制破骨细胞的形成，说明奈拉替尼可能具有双重作用，既能保护软骨，又能抑制破骨细胞的形成，奈拉替尼可能成为治疗OA的一种有价值的潜在药物。

摘要译文

关键词：

骨关节炎; 奈拉替尼; 软骨细胞; 破骨细胞; MAPK/NF-κB信号通路

学位年度：

2024

学位类型：

硕士

学科专业：

外科学（骨外科）

导师：

陈海啸

中图分类号：

R767.22;R684.3[关节炎⑨]

学科分类号：

100202[普通外科学];100203[骨科学]