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海洋天然产物抗非小细胞肺癌的活性筛选及作用机制研究认领

作者：

于丹丹

学位授予单位：

广东医科大学

摘要：

目的：　　1.从海洋天然产物(Marinenaturalproducts,MNP)中筛选出具有抗非小细胞肺癌(Non-smallcelllungcancer,NSCLC)增殖能力的活性化合物。　　2.探讨活性化合物对NSCLC的抗肿瘤作用。　　3.探讨活性化合物抑制NSCLC的作用机制。　　方法：　　首先将H1975、H1299、A549和MDA-MB-231细胞分为对照组和不同浓度的MNP处理组（处理浓度为0.08、0.4、2、10、50μM）。用MTT法从MNP中筛选出具有强效抗肿瘤增殖能力的活性化合物。随后，通过文献调研，挑选出尚未进行过深入抗肿瘤机制研究的化合物，通过比较化合物的活性并考虑到实验室分离得到的化合物量，做出合适的实验设计。　　随后，在体外实验中，形态学观察，吖啶橙染色、克隆形成实验、划痕实验、侵袭实验、流式细胞术等技术分别检测活性化合物对细胞形态、细胞克隆形成、细胞迁移、细胞侵袭、细胞凋亡、细胞周期、细胞线粒体膜电位、细胞内活性氧生成量的影响。免疫荧光检测相关蛋白表达水平，Westernblot检测细胞增殖、转移、凋亡相关蛋白水平。人类磷酸化RTK阵列试剂盒筛选抗肿瘤作用靶点，Westernblot检测靶点蛋白及相关信号通路的蛋白表达水平，RT-qPCR法验证靶点的mRNA水平。在体内实验中，采用裸鼠异种移植瘤模型研究活性化合物对肿瘤增殖的影响，苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosinstaining,Hamp;E)检测心肝脾肺肾的病变情况，免疫组化法（Immunohistochemistry,IHC）检测Ki-67指标，免疫荧光法(Immunofluorescence,IF)检测靶点蛋白表达情况。　　结果：　　1.活性化合物筛选：在582个化合物中，共有40个化合物显示出强抗肿瘤增殖的活性（IC50＜10μM）。通过文献调研，大环内酯类化合物UlapualideB(UlaB)和西松烷二萜类化合物3-dehydroxylpresinularolideB（compound10）未进行过深入的抗肿瘤机制研究，且分离得到的化合物量可以完成后续实验。最终选取上述两种化合物做进一步的抗肿瘤机制研究。两者相较而言，UlaB的活性更好，得到的化合物量可以支持更多的实验开展。　　2.UlaB的抗肿瘤活性及其作用机制研究：UlaB在体内外均表现出显著的抗NSCLC活性。体外实验中，UlaB抑制NSCLC细胞增殖及集落生成，诱导细胞周期阻滞在G2/M期进而诱导DNA损伤，减弱CyclinB1入核能力;此外，UlaB可以呈时间和剂量依赖性抑制细胞转移，诱导p-γH2AX阳性细胞增加，降低线粒体膜电位水平并刺激活性氧的生成;下调ErbB3的mRNA和蛋白水平，并影响ErbB3相关信号通路蛋白（如ROR1/WNT5A、JAK2/STAT3）的表达，从而发挥抗肿瘤作用。体内实验中，UlaB能够抑制裸鼠体内移植肿瘤的增殖;小鼠心肝脾肺肾器官无明显病变;Ki-67阳性细胞减少;下调ErbB3和ROR1的蛋白表达。关于UlaB的抗癌机制，结果表明，UlaB通过激活ErbB3和ROR1信号通路来抑制NSCLC的增殖。这些结论表明UlaB具有潜在的抗NSCLC的作用。　　3.Compound10的抗肿瘤活性及其作用机制研究：compound10在体外具有显著的抗肿瘤活性。compound10对A549细胞具有明显的细胞毒性，通过诱导A549细胞周期阻滞在G2/M期及细胞凋亡发挥抗肿瘤活性。此外，compound10抑制A549细胞的转移，诱导活性氧生成。关于compound10的抗癌机制，目前的研究结果表明，compound10可减少CyclinB1蛋白的表达，同时，还可以影响肿瘤转移相关蛋白MMP-2、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin，肿瘤凋亡相关蛋白Cleaved-PARP、Cleaved-caspase3、Bcl-2的表达量。此外，compound10可以抑制ROR1-ErbB3活性，影响下游Src/STAT3信号通路的表达，从而达到抗肿瘤效果。总体而言，这些结论表明compound10具有潜在的抗肿瘤作用。　　结论：　　1.UlaB抑制细胞转移，诱导细胞周期阻滞和DNA损伤而抑制细胞增殖，可能与抑制ROR1-ErbB3信号通路有关;2.Compound10抑制非小细胞肺癌细胞转移、诱导细胞周期阻滞而抑制细胞增殖并且诱导细胞凋亡，可能与抑制ROR1-ErbB3信号通路有关。

摘要译文

关键词：

非小细胞肺癌; 海洋天然产物; 人表皮生长因子受体3; 酪氨酸激酶样孤儿受体1; 细胞凋亡

学位年度：

2024

学位类型：

硕士

学科专业：

药学

导师：

罗辉郭跃伟

中图分类号：

R734.2[肺肿瘤⑨]

学科分类号：

1002[临床医学]