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三株土壤真菌次级代谢产物的化学成分及生物活性研究认领

作者：

纪彦南

学位授予单位：

河北医科大学

摘要：

微生物种类极其繁多，代谢途径多样，其代谢产物具有化学结构新颖、结构种类丰富多样、生物活性广泛、成药性好的特点，是寻找药用先导化合物极其重要的资源宝库。时至今日，人们仍然不断从微生物特别是丝状真菌的代谢产物中发现结构新颖的化合物，这些结构独特的代谢产物为新药研发提供了持续稳定的物质基础。为了寻找结构骨架新颖、生物活性良好的药物先导物，本研究以土壤真菌为研究对象，开展次级代谢产物的化学成分及生物活性研究，其主要内容包括：目的菌株的筛选和鉴定、代谢产物的分离和结构鉴定、单体化合物的活性筛选评价研究。　　目的：从土壤真菌代谢产物中发现结构骨架新颖、生物活性良好的次级代谢产物，为微生物创新药物研发奠定物质基础。　　方法：　　1．利用分离自湖北神农架、北京五虎台长城及云南鸡足山土壤样品的10株真菌小规模发酵的次级代谢产物进行蛋白酪氨酸磷酸化酶（PTPs）活性抑制实验及人源肿瘤抗增殖实验进行活性筛选，结合HPLC-PDA化学筛选，确定了次级代谢产物丰富、生物活性良好、浸膏提取率较高的三株真菌F01ZB1707、NCC3968、NCC2294作为本课题的研究对象。利用传统菌株鉴定方法及现代分子生物学技术将3株目标菌株初步鉴定为曲霉Aspergillusgorakhpurensis、焦曲霉Aspergillusustus和球孢木生红曲霉Xylogonesphaerospora。对三株真菌进行大规模发酵及次级代谢产物的系统分离并对部分单体化合物进行了体外生物活性评价。　　2．采用有机溶剂分级萃取的方法对三株真菌的大规模发酵培养物进行粗提取。采用一系列色谱分离技术如硅胶柱色谱、SephadexLH-20凝胶柱色谱、反相中压柱色谱以及制备高效液相色谱对三个粗提取物的化学成分进行系统分离，得到单体化合物。综合应用现代光谱学和波谱学技术(IR、UV、LC-ESIMS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC、NOESY、OR、ECD、量子化学计算等)来鉴定化合物的结构。　　3．对部分次级代谢产物单体化合物利用PTPs模型和4种人源肿瘤细胞进行体外活性评价。其中PTPs抑制活性采用比色法，肿瘤细胞增殖抑制活性测定采用MTT法。　　结果：1.三株目标真菌F07ZB1707、NCC3968和NCC2294初步鉴定为曲霉Aspergillusgorakhpurensis、焦曲霉Aspergillusustus和球孢木生红曲霉Xylogonesphaerospora。　　2.从三株土壤真菌发酵提取物中分离得到了81个单体化合物（含22个新化合物）并全部阐明了结构，其中包括6个甾体（1,3,7,8,74,75）、6个四环三萜（2,4-6,14,15）、1个二萜（32）、3个蒽醌（23,31,53）、10个生物碱（含4个二酮哌嗪类(10,57,60,69)、2个吲哚类(71,77)、2个酰胺类生物碱（19,20,80,81）、2个杂环生物碱（80,81）），8个常见苯环衍生物、1个大环内酯类衍生物、4个不饱和脂肪酸、4个不饱和脂肪酸甘油酯、1个丁二酸甲酯、33个芳香聚酮类衍生物（含5个山酮、24个色原酮衍生物）及源自真菌固体培养基中的4个异黄酮类化合物。本研究共发现22个新化合物（包含1个甾醇、4个萜类、4个生物碱、2个山酮、11个聚酮类），这些新化合物的发现进一步丰富了土壤真菌代谢产物库，为寻找药物先导化合物奠定了物质基础。81个单体化合物具体鉴定结果如下：(22E)-5α,8α-Epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol(1)、Lanosterol(2)、Ergosta-5,7,22-triene-3β-ol(3)、23,24,25,26,27-Pentanorlanost-8-en-3β,22-diol(4)、Euphol(5)、AspergorakhinB(6*)、24-Ethyl-5α-cholest-ane-3β,5,6β-triol(7)、AspergorakhinA(8*)、Vanillicacid(9)、cyclo-(L-Try-L-Pro)(10)、AspergorakhinK(11*)、(7S)-2-(Hydroxymethyl)-3-(1-hydroxypr-opyl)phenol(12)、(2S)-7-Hydroxy-2-(2-hydroxypropyl)-5-methylchromone(13)、AspergorakhinC(14*)、AspergorakhinD(15*)、Dibutylphthalate(16)、3-(2,6-Dihydroxyphenyl)-4-hydroxy-6-methylisobenzofuran-1(3H)-one(17)、AspergorakhinI(18*)、AspergorakhinM(19*)、AspergorakhinN(20*)、AspergorakhinL(21*)、LeptosphaerinD(22)、Isorhodoptilometrin(23)、AspergorakhinO(24*)、MangrovamideK(25)、MangrovamideJ(26)、AspergorakhinF(27)、AspergorakhinH(28*)、AspergorakhinJ(29*)、AspergorakhinG(30*)、DemethylmacrosporineI(31)、AspergorakhinP(32*)、Syringicacid(33)、2,4-Dichlorobenzoicacid(34)、1-(4-Hydroxyph-enyl)-3-methoxypropan-1-one(35)、Fidaxomicin(36)、(8E,10E)-12-hydroxy-7-oxo-8,10-octadecadienoicacid(37)、8-Hydroxy-(9Z,12Z)-octadecadienoicacid(38)、Linoleicacid(39)、(R)-2,3-Dihydroxypropyl-(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoate(40)、(S)-2,3-Dihydroxypropyl-(9Z,12Z)-Octadeca-9,12-dienoat-e(41)、AspergorakhinE(42*)、5-Hydroxymethyl-furaldehyde(43)、(R)-6-Hydroxymellein(44)、(3R)-Methoxy-6,8-dihydroxy-3-methyl-3,4-di-hydroisocoumarin(45)、5-Dimethyl-7-hydroxychromone(46*)、4-Hydroxy-5-propionyl-1,3-di-O-methylpyrogallol(47)、XylogosphinA(48*)、XylogosphinB(49*)、Nectriapyrone(50)、4,8-Dihydroxy-3,4-dihydronaphthalen-1(2H)-one(51)、XylogosphinC(52*)、Emodin(53)、3(ζ)-Hydroxy-octadeca-4(E),6(Z),15(Z)-trienoicacid(54*)、(2S)-α-(9′Z,12′Z,15′Z)-Octadecatrienoicacidmonoglyceride(55*)、(2S)-1-Linoleoylglycerol(56)、cyclo(S-Pro-S-Leu)(57)、Lachnumfuran(58*)、Bis(2-ethylhexyl)phthalate(59)、cyclo(R-Pro-R-Phe)(60)、(3R,4S)-(+)-5-Chloro-4,6,8-trihydroxybenzopyranl-one(61)、Genistein(62)、XylogosphinD(63*)、Genitein(64)、Piceol(65)、Daidzein(66)、5-Methoxydaidzein(67)、Methylhydrogensuccinate(68*)、cyclo(Pro-Pro)(69)、3-Methoxy-2-methyl-4H-pyran-4-one(70)、(1H-Indol-3-yl)oxoacetamide(71)、5-(Undeca-3'',5'',7''-trien-1''-yl)furan-2-ol(72)、CarnemycinE(73)、(22E)-5a,8a-Epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol(74)、5α,8α-Epidioxy-23-methyl-(22E,24R)-ergosta-6,22-dien-3β-ol(75)、CarnemycinB(76)、(2S)-3,3-Bis(3''-indolyl)propane-1,2-diol(77)、Pyrolin(78*)、Apocynin(79)、AspergustinA(80*)、AspergustinB(81*)。　　3.抗肿瘤活性筛选发现2个化合物(6,8)对4种人源肿瘤细胞株具有增殖抑制活性，甾体类化合物8对4种肿瘤细胞具有中等的抗增殖活性，尤其是对人源肺癌肿瘤细胞A549表现出明显的抗增殖活性，其IC50值为6.75μM;化合物6对HeLa、A549肿瘤细胞表现出较弱的抗增殖活性，IC50值范围为61.9-83.4μM。　　4.蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)体外抑制活性的筛选中发现化合物8对PTP1B及SHP1表现出非常强的抑制活性，其IC50值分别为0.57,1.19μM，其活性分别约为阳性对照Na3VO4的2倍和3.7倍;化合物8对CathepsinB同样表现出良好的抑制活性，IC50值为8.18μM，其活性略逊于阳性对照亮肽素;化合物6对SHP1及TCPTP表现出明显的抑制活性，其IC50值分别为6.18μM和7.50μM。化合物11对PTP1B表现出一定的选择性抑制活性，其IC50值为12.06μM，但对其他3种PTPs及CathepsinB，没有表现出明显的抑制活性。不饱和脂肪酸甘油酯类化合物56对PTP1B表现出良好的选择性抑制活性，其IC50值为10.55μM，而对其他三种PTPs的抑制活性很弱，IC50值范围在42.23-94.55μM。化合物72对CD45表现出良好的选择性抑制活性，其IC50值达到5.13μM，而对其他三种PTPs活性明显降低，IC50值范围在33.37-111.16μM。化合物78对TCPTP表现出良好的选择性抑制活性，其IC50值可达0.56μM，对PTP1B、SHP1的IC50值分别为16.01，12.08μM，而对CD45没有表现出抑制活性。对羟基苯乙酮类化合物79仅对SHP1表现出较强的抑制活性，其IC50值分别为21.59μM，而对其他三种酶并没有表现出抑制活性。　　结论：　　本研究以三株土壤真菌为研究对象，对其发酵提取物进行了系统的化学成分研究和部分单体化合物的生物活性评价，共分离并鉴定了81个单体化合物，包含22个新化合物，分别为1个甾醇（8）、4个萜类（6,14,15,32）、4个生物碱（19,20,80,81）、2个山酮（21,24）、11个聚酮类衍生物（11,18,27-30,42,48,49,52,63），这些新化合物的发现，进一步丰富了土壤真菌的代谢产物库，为寻找药物先导化合物奠定了物质基础。生物活性评价发现化合物8对人源肺癌肿瘤细胞A549表现出明显的抗增殖活性，并且对PTP1B及SHP1表现出极强的抑制活性，其IC50值分别为0.57,1.19μM,具有成为PTP抑制剂先导化合物的潜力。发现了4个具有PTPs选择性抑制活性的化合物（56,72,78,79），不饱和脂肪酸甘油酯类化合物56对PTP1B表现出良好的选择性抑制活性，具有开发为PTP1B选择性抑制剂的潜力，本研究首次发现这类化合物可以作为PTP1B酶抑制剂先导化合物。

摘要译文

关键词：

土壤真菌; 次级代谢产物; 化学成分; 生物活性

学位年度：

2021

学位类型：

博士

学科专业：

药理学

导师：

史清文朱华结

中图分类号：

R284.1[化学分析与鉴定]

学科分类号：

1005[中医学];100803[中药鉴定学];100804[中药化学];100805[中药分析学]