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基于内质网应激的斑蝥素致肝细胞毒性研究认领

作者：

刘方

学位授予单位：

遵义医科大学

摘要：

目的：研究斑蝥素（Cantharidin,CTD）致LO2细胞毒性的作用机制，以期为CTD的肝毒性提供依据。　　方法：　　1.CTD致LO2细胞毒性分子机制研究　　培养人肝LO2细胞，CCK-8法检测不同浓度CTD（0、6.25、12.5、25、50和100μM）对其增殖的影响;采用试剂盒检测CTD（0、6.25、12.5、25和50μM）对LO2细胞中ALT、AST、LDH和MDA含量及SOD、GSH活性的影响;采用免疫荧光染色法和透射电镜观察CTD对LO2细胞自噬、凋亡等的影响;采用流式细胞术和Hoechst33342检测CTD对LO2细胞凋亡的影响;采用蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测CTD对LO2细胞内质网应激（Endoplasmicreticulumstress,ERS）、自噬和凋亡通路相关蛋白的蛋白表达水平，同时加入ERS激动剂（2DG）进行反证。　　2.基于脂质组学的CTD致LO2细胞毒性研究　　采用不同浓度的CTD（0、6.25和25μM）干预LO2细胞12h后，胰酶消化，加入预冷的淬灭试剂，低温离心，收集细胞，-80℃保存备用。分析时置冰上解冻5min后，离心;取上清300μL加入1mL的脂质提取液;以100μL流动相复溶后LC-MS分析。采用MWDB代谢物数据库，根据保留时间（Retentiontime,RT），前体离子和产物离子鉴定代谢物结构。采用MultiQuant软件对获取的数据进行定量分析，以获得包含每种代谢物的RT，离子和峰面积的矩阵。将其导入SIMCA-P14.1(Umetrics,Sweden)进行多元统计分析，包括主成成分分析（PCA）、偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘-判别分析法（OPLS-DA）。通过变量重要性投影（VIP）＞=1和fold-change＞=5或fold-change＜=0.2筛选CTD致LO2细胞的差异代谢物，进而分析主要代谢通路。　　结果：　　1.CTD致LO2细胞毒性的分子机制研究　　CCK-8实验结果显示，CTD可剂量依赖性的抑制LO2细胞增殖;CTD可显著升高ALT、AST、LDH和MDA含量（P＜0.01），显著降低了GSH-PX和SOD活性（P＜0.01）;透射电镜结果可得到在CTD作用后，细胞出现明显的自噬双层膜结构;荧光显微镜下可见CTD诱导LO2细胞出现微管相关蛋白1轻链3（LC3）绿色荧光的分布;Westernblot结果显示，当CTD浓度为6.25μM时，GRP78、PERK、p-PERK、ATF4、XBP-1s和CHOP蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），当CTD浓度为12.5、25和50μM时，上述蛋白的表达水平显著降低（P＜0.05）。当2DG预干预12h，与单纯CTD组相比，GRP78、PERK、p-PERK、ATF4、XBP-1s和CHOP蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。CTD显著上调了Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Atg3、Atg4A、Atg4B和Atg7的蛋白表达水平（P＜0.05），显著下调了GABARAP的蛋白表达水平（P＜0.05）;同时CTD上调了caspase-3和Bax/Bcl-2比值蛋白表达水平（P＜0.05）。当2DG预给药12h后，CTD再分别继续干预LO2细胞15min、6h和12h以检测自噬和凋亡的关键蛋白，当50μMCTD干预15min时，Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Bax/Bcl-2比值较单独CTD组显著升高（P＜0.05）。但当50μMCTD干预6h和12h时，Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Bax／Bcl-2比值均较单独50μMCTD组显著降低（P＜0.05）。流式细胞术结果显示CTD作用LO2细胞12h后凋亡率呈剂量依赖性增加（P＜0.01），CTD作用于LO2细胞24h后凋亡率呈剂量依赖性增加（P＜0.01）。但当CTD浓度为25μM和50μM时，凋亡率呈剂量依赖性下降，细胞死亡率上升（P＜0.05）。并且CTD干预LO2细胞后可见典型的凋亡形态变化。　　2.基于脂质组学的CTD致LO2细胞毒性研究　　与空白对照组相比，CTD高剂量组发现差异代谢物33个，其中磷脂酰胆碱类1个、单甘油酯类1个、神经酰胺类1个、酰基肉碱类4个和甘油三酯类26个，且磷脂酰胆碱类、酰基肉碱类和单甘油酯类代谢物代谢水平被显著下调，而神经酰胺类和甘油三酯类代谢物代谢水平被显著上调（P＜0.05）;低剂量组发现差异代谢物6个，其中3个为酰基肉碱类、3个为甘油三酯类，且代谢物代谢水平被显著上调（P＜0.05），以上说明CTD致LO2细胞毒性主要与甘油三酯和酰基肉碱代谢紊乱有关。　　结论：　　低剂量时CTD可激活ERS，高剂量时CTD可抑制ERS，进而诱导LO2自噬和凋亡产生细胞毒性。进一步脂质组学发现CTD致LO2细胞毒性细胞代谢轮廓发生显著的变化，其致LO2细胞毒性机制主要与甘油三酯和酰基肉碱代谢等异常有关。以上结论可为CTD引起的肝毒性提供了科学依据。

摘要译文

关键词：

斑蝥素; 肝毒性; 内质网应激; 细胞凋亡; 脂质组学

学位年度：

2020

学位类型：

硕士

学科专业：

病原生物学

导师：

李晓飞张建永

中图分类号：

R329.28;R285[中药药理学]

学科分类号：

100505[临床中药学];100801[中药资源学];100806[中药药理学];100808[临床中药学]