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栉孔扇贝在PAHs和TCDD胁迫下芳烃受体信号途径与Ⅱ相解毒代谢酶不同亚族功能的研究认领

作者：

赵亚楠

学位授予单位：

中国海洋大学

摘要：

持久性有机污染物（Persistentorganicpollutants，POPs）被认为是21世纪影响人类生存和健康的重要环境问题之一。多种POPs会对人类和动物的神经系统，免疫系统，内分泌系统和生殖系统造成毒害。其中，多环芳烃（Polycyclicaromatichydrocarbons，PAHs）和二噁英（dioxins）均为POPs中的重要种类。随着工业化的进程，海洋环境中的PAHs和二噁英污染日益严重，因此水生生物对于此类物质的解毒代谢机制逐渐受到广泛的关注。基于此，本文选取经济贝类栉孔扇贝（Chlamysfarreri）作为研究对象，进行了栉孔扇贝芳烃受体蛋白（AhR）与外源性污染物配体结合的研究，并且进一步分析了栉孔扇贝在苯并芘（benzo[a]pyrene，B[a]P）、?（chrysene，CHR）和菲（phenanthrene，PHE）三种PAHs单一及混合胁迫下AhR信号途径的响应和Ⅱ相解毒代谢酶不同亚族的功能特点，同时初步研究了栉孔扇贝在2，3，7，8-四氯-二苯并-对-二噁英（2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）胁迫下的解毒代谢机制，以期为海洋双壳贝类响应POPs暴露的机制提供更多信息，同时为海洋生物监测提供更多依据。　　1栉孔扇贝芳烃受体蛋白与外源配体结合的研究　　由于人为活动的原因，水生生物更大程度地暴露于持久性有机污染物POPs下，因此水生生物在POPs胁迫下的代谢机制受到更多的关注。芳烃受体蛋白（arylhydrocarbonreceptor，AhR）与污染物的结合是AhR在解毒代谢中发挥调控作用的关键，但是双壳贝类在这方面的研究却非常有限。为了查明五种代表性的POPs是否可以与栉孔扇贝AhR相互作用，本研究基于酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）构建了包含栉孔扇贝AhR与外源性物质响应元件（xenobioticresponseelements，XRE）的重组酵母Y187CfAhR/XRE，并用一系列浓度的TCDD，β-萘黄酮（β-naphthoflavone，BNF）、B[a]P、CHR和PHE）处理该重组酵母。依据前人的研究和预实验将TCDD和BNF的浓度设置为0.001、0.01、0.1、1、10、100、1000nM，B[a]P、CHR和PHE的浓度设置为0.001、0.01、0.1、1、10、50、100μM。报告基因产物β-半乳糖苷酶活力的结果显示：不经任何处理，栉孔扇贝AhR可以与XRE相互作用。重组酵母的β-半乳糖苷酶活力可以被TCDD显著诱导，表明TCDD是栉孔扇贝AhR的一种潜在激动剂，但在我们的实验中并没有充分的证据表明其他四种受试化合物可以与栉孔扇贝AhR结合。　　2栉孔扇贝在单一/混合PAHs胁迫下芳烃受体蛋白信号途径与Ⅱ解毒代谢酶不同亚族功能的研究　　本章从AhR途径和Ⅱ解毒代谢酶不同亚族的功能两方面进行研究，实验染毒浓度设置为B[a]P（0.7，2.1μg/L）、CHR（0.7，2.1μg/L）、PHE（0.7，2.1μg/L）、B[a]P+CHR+PHE（0.7+0.7+0.7，2.1+2.1+2.1μg/L）和对照组，染毒实验共进行15天，取样组织为消化盲囊，取样时间点为0、1d、3d、6d、10d、15d。结果表明：AhR信号通路关键基因AhR、ARNT、HSP90和XAP2均可被B[a]P、CHR和PHE单一及混合染毒显著诱导，XAP2的表达模式呈现显著的时间-剂量效应，且三种单一PAHs在相同浓度处理下对XAP2的诱导程度基本一致。　　对Ⅰ相代谢相关基因的研究表明，CYP1A1的表达量在B[a]P、CHR、PHE以及这三种污染物混合处理下呈剂量效应变化，在染毒的第1-10天，各污染物对CYP1A1的诱导效应为CHRgt;B[a]Pgt;PHE，第15天时B[a]P处理组CYP1A1表达量超过了CHR，且混合胁迫对CYP1A1的诱导效应大于单一胁迫，这三种PAHs对CYP1B1的诱导效应却为PHEgt;CHRgt;B[a]P。　　Ⅱ相解毒代谢酶GST各亚型可被不同的污染物显著诱导，且各亚型的响应模式有所不同。GST-theta的整体表达水平相较于其他GSTs较高，暗示GST-theta对于PAHs胁迫可能更为敏感。GST-sigma2和GST-3的表达量在第6天时达到峰值，且诱导效应为CHRgt;B[a]P+CHR+PHEgt;PHE。PHE比混合处理组对GST-microsomal有更强的诱导效应，且GST-microsomal的表达量与PHE和B[a]P+CHR+PHE处理浓度均呈正相关，作者认为GST-microsomal表达量也可作为PHE和B[a]P+CHR+PHE胁迫下的生物标记物。pi型GST在本研究中表现出了明显的剂量效应，且诱导效应为B[a]P+CHR+PHEgt;PHE。SULT各亚型在本研究中也展现出了不同的功能趋势。B[a]P对SULT1B1展现出较强的诱导效应。B[a]P、CHR、PHE及其混合处理均能诱导SULT1C2的表达，且在PHE处理组SULT1C2表达量变化呈现明显的剂量-效应，暗示SULT1C2可能也参与PAHs类致癌物的生物转化过程。B[a]P对SULT1C4的表达量无显著的诱导效应，但CHR和PHE以及混合处理组可诱导SULT1C4的高表达。　　关于Ⅲ相解毒代谢相关基因的研究表明，各处理组ABCB1的表达量自实验开始就迅速上调，且不同污染物处理下ABCB1的变化模式并不相同，B[a]P处理组于第6天达到最大值后开始下降，CHR、PHE处理组除在第6天达到峰值外，实验初期便出现了“小高峰”，推测在不同的时间点ABCB1主要转运的底物有所不同。ABCC1在整个实验周期内表达量均较高，说明ABCC1在持续地发挥作用。B[a]P处理组的ABCG2表达量在整个实验周期内保持持续上升的状态直至第15天实验结束时，且呈现明显的剂量效应，作者认为ABCG2可以作为B[a]P暴露的灵敏指示指标。　　3栉孔扇贝在TCDD胁迫下解毒代谢过程与生物标志物的研究　　本实验将栉孔扇贝分别暴露于0、0.001、0.01和0.1μg/L的2,3,7,8-四氯二苯并-对-二噁英（TCDD），分别于0、1、3、6、10、15d取样，取样组织为消化盲囊，通过对解毒代谢关键基因表达量的测定，初步探究了栉孔扇贝在TCDD胁迫下的解毒代谢机制。结果表明：TCDD对栉孔扇贝AhR信号通路、I相、II相和III相代谢过程各基因表达均具有显著影响。各基因在TCDD胁迫下呈峰值变化，均于10d达到最高值。其中，HSP90、XAP2和ABCB1表达量呈现剂量效应，CYP1A1在1-10d呈剂量效应，AhR、GST-microsomal、SULT1B1、UGT、ABCC1和ABCG2在各处理组的表达量均为：中浓度组gt;高浓度组gt;低浓度组。此外，综合生物标志物响应（IBR）分析表明ARNT和ABCG2表达量在各个时间点均具有较高响应水平，是对于TCDD胁迫更为灵敏的生物标志物。

摘要译文

关键词：

栉孔扇贝; 多环芳烃; 二噁英; 芳烃受体信号途径; 解毒代谢酶; 基因表达

学位年度：

2018

学位类型：

硕士

学科专业：

水生生物学

导师：

潘鲁青

中图分类号：

X503.225[鱼类、水产];R73[肿瘤学];R32[人体形态学]

学科分类号：

0713[生态学];080707[能源环境工程];083002[环境工程];100101[人体解剖与组织胚胎学];1002[临床医学];100601[中西医结合基础医学]