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阳离子纳米探针增强光声成像追踪骨关节炎动态进展认领

作者：

肖姝艺

学位授予单位：

温州医科大学

摘要：

目的：骨关节炎(OA)是临床最常见的退行性关节疾病，给患者和社会造成巨大的经济负担。目前缺乏早期有效的诊断和追踪OA疾病动态进展的方法。关节软骨的损伤、退变是其早期和主要的病理改变。关节软骨基质中带有阴离子的糖胺聚糖(GAGs)含量的减少是OA发生发展的标志性分子事件。本研究旨在基于黑色素纳米颗粒，构建富含阳离子的光声纳米探针，通过静电吸引特异性靶向关节软骨中的GAGs，结合光声成像探究阳离子探针监测OA疾病进展及分期的可行性，为构建OA纳米诊疗一体化载体提供实验基础。　　方法：(1)黑色素纳米粒(MNPs)的制备：依次使用0.1NNaOH溶液和0.1NHC1溶液通过调节pH以溶解20mg酪氨酸衍生的合成黑色素，经超声、过滤、去离子水冲洗后冻干，获得带有阴离子、水溶性黑色素纳米粒(MNPs)。　　(2)阳离子聚赖氨酸一黑色素纳米粒(PLL-MNPs)的制备与表征：5mgMNPs溶于10ml去离子水中，0.1NNaOH调节pH至9，并超声10分钟。加入10ml，0.25mM的聚赖氨酸(PLL)溶液(pH=9)，30℃下磁力搅拌24h，通过PLL和MNPs之间的静电相互作用形成PLL-MNPs，去离子水多次冲洗，去除多余聚合物，得到最终的PLL-MNPs。红外光谱法确认目标产物PLL-MNPs的结构。透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)仪器测量PLL-MNPs的粒径大小与形态;Zeta电位分析仪测定PLL-MNPs的电位;在PLL-MNPs水溶液中测量其光声光谱及光声特性;680nm激光连续照射检测PLL-MNPs的光稳定性。　　(3)体外软骨实验：取大鼠新鲜膝关节软骨，用硫酸软骨素酶ABC溶液（0，0.1，0.3，和0.5U/ml的50mmolTris，0.02%牛血清白蛋白和60mmol醋酸钠缓冲液，pH8）在37℃下处理24小时，得到含有不同GAGs浓度的关节软骨。经PLL-MNPs(0.5mg/ml)孵育24小时，进行光声检测，记录光声信号值并绘制相关曲线，验证和分析阳离子光声探针对GAGs的靶向性及监测关节软骨中GAGs含量变化的能力。　　(4)细胞毒性实验：MTT法考察一系列浓度梯度的PLL-MNPs对大鼠软骨细胞的细胞毒性。　　(5)PLL-MNPs追踪体内OA疾病进展的考察：选用切断板胫韧带手术致内侧半月板不稳(DMM)诱导的方法建立小鼠OA模型。利用同一只小鼠左右两侧后肢膝关节作为对照研究以减少潜在的个体差异，右侧膝关节行DMM造模，左侧关节行假手术作为正常对照组。首先取DMM术后第四周小鼠，关节腔内注射10μL的PLL-MNPs(0.5mg/mL)，通过观察各时间点光声图像及量化光声信号强度考察PLL-MNPs诊断骨关节炎小鼠软骨退变的可行性。在DMM术后，小鼠关节腔内注射10μL的PLL-MNPs(0.5mg/mL)进行光声成像，并进行X线检查，连续观察10周，评估PLL-MNPs追踪体内骨关节炎进展的有效性。每一阶段实验结束后取小鼠膝关节进行组织病理检查，验证软骨退变、GAGs含量的变化，检测软骨细胞死亡与骨赘形成。　　(6)考察PLL-MNPs光声纳米探针在体内的生物分布：向健康小鼠膝关节内注射10μLPLL-MNPs(0.5mg/mL)或PBS，分别在24h、96h处死小鼠。收集包括心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、肌肉和骨骼等的主要器官组织。将各器官分别包埋在琼脂糖凝胶中进行光声成像，计算光声信号强度值。将10μL浓度为0.5mg/mL的PLL-MNPs注射到正常小鼠膝关节内，不同时间点进行光声成像，监测PLL-MNPs在关节内的代谢。　　结果：(1)通过控制反应pH、温度(30℃)、氮气保护，本实验最终合成PLL-MNPs光声纳米探针。PLL-MNPs纳米颗粒呈深棕色，水合粒径稳定约为42.5nm。PLL-MNPs光声探针水溶液吸收波长范围较宽，峰值在680nm，因此选用680nm作为后续实验光声激发波长。Zeta电位分析仪测定合成的PLL-MNPs的电位为+32.5±9.3mV。PLL-MNPs探针溶液在680nm波长的激光照射下1小时，PLL-MNPs的吸收几乎没有减弱，说明PLL-MNPs具有良好的光稳定性。(2)体外软骨实验结果显示，经过PLL-MNPs孵育的正常关节软骨，光声信号强度明显增强（孵育前：148±23a.u.，9呼育后：2798±98a.u.，p＜0.01），并且PLL-MNPs光声信号强度与软骨中GAGs含量成正相关(R2=0.87)，表明PLL-MNPs增强的光声成像具有灵敏检测关节软骨中GAGs含量变化的能力，在光声图像中可以清楚区别正常软骨与退变软骨。(3)0-200μg/ml的PLL-MNPs与大鼠软骨细胞孵育24h后，细胞存活率均超过90%，表明PLL-MNPs生物相容性良好。(4)体内实验结果表明，造模后第4周，注射PLL-MNPs后，3小时探针在关节腔内显著聚集，表现为局部亮度增加、光声信号明显增强，而OA关节内光声信号(1698±86a.u.)明显低于正常关节（2245±72a.u.，p＜0.05），这一结果表明通过PLL-MNPs靶向GAGs含量变化，早期即可分辨软骨退变，从而实现疾病的早期诊断;对比临床常用的X线检查，在DMM术后第2、4周小鼠膝关节未见特征性的OA表现。在监测骨关节炎疾病进展中，通过连续观察注射探针后小鼠光声成像发现，OA关节内光声信号强度随造模时间的延长呈连续下降趋势，各周之间差异具有明显的统计学意义(p＜0.05)。组织病理结果提示，软骨退变、GAGs含量的变化、软骨细胞死亡及骨赘形成的量化结果与光声信号强度具有良好的相关性;除软骨厚度外，OA关节的平均光声信号强度与OA损伤的组织学参数呈负相关(p＜0.05)。(5)PLL-MNPs在正常小鼠膝关节中的半衰期约为48小时。　　结论：本课题成功制备了光声特性及生物相容性良好的阳离子光声纳米探针PLL-MNPs。通过体外软骨及体内实验研究证实，PLL-MNPs能够特异靶向软骨中的GAGs，并敏感的监测到软骨基质中GAGs含量变化，从而实现可视化追踪骨关节炎疾病进展及分期。

摘要译文

关键词：

骨关节炎; 关节软骨; 糖胺聚糖; 黑色素; 光声分子成像

学位年度：

2021

学位类型：

硕士

学科专业：

药学

导师：

陈瑞杰

中图分类号：

R684.3[关节炎⑨]

学科分类号：

100202[普通外科学];100203[骨科学]