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EGCG对氯化锂-匹鲁卡品诱导癫痫大鼠的神经保护作用及其机制研究认领

作者：

曲珍珍

学位授予单位：

河北医科大学

摘要：

癫痫是一种以脑神经元异常同步放电导致的反复发作为特征的慢性脑部疾病，是神经科常见病、多发病之一。全球约有6500万癫痫患者，在我国癫痫患病率约为7‰，据此估计我国癫痫患者不少于900万。其中约30%为难治性癫痫。癫痫患者常常伴随有焦虑、精神病、抑郁和认知缺陷等合并症，据报道约有半数以上癫痫患者伴有认知功能障碍。近几年发现抗癫痫药本身也可导致认知功能障碍。因此，临床上亟待需要开发既能抑制癫痫发作同时能改善癫痫相关的认知障碍的新型药物。　　颞叶癫痫(Temporal lobe epilepsy，TLE)是最常见的难治性癫痫类型。TLE常常由脑损伤诱导，脑损伤后触发了细胞和分子水平的改变，增加了癫痫发作的几率。颞叶癫痫以反复性自发性癫痫发作(SRS)和海马硬化为主要特点，伴有明显的药物抵抗。临床研究表明，TLE患者的认知功能明显降低。TLE对手术及抗癫痫药物治疗效果均不明显，因此TLE仍是当前癫痫领域研究的热点及难点，深入研究TLE的病因、病理、发病机制及预防措施，具有重要理论价值及临床意义。氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠行为学和海马神经元损伤的病理学改变均与人类颞叶癫痫相似，因此是目前研究TLE的常用模型。　　以往的研究中，离子通道异常、神经递质异常、神经网络重组、信号转导、线粒体功能异常、自身抗体等是癫痫机制研究的重点。近年来大量的研究已经表明炎症是癫痫产生及癫痫发作的关键因素之一。抗炎治疗在临床和实验研究中都获得了良好的治疗效果。Toll样受体4Toll样受体(Toll-like receptor 4,TLR4)是一种识别病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)的受体，能识别损伤或应激所致的“内源性危险信号”，激活核转录因子kappaB(Nuclearfactor-k-genebinding,NF-κB)发生磷酸化，磷酸化的NF-κB(PhosphorylatedNuclearfactor-k-genebinding,p-NF-κB)进入细胞核，诱导促炎因子基因表达，脑内炎症导致癫痫反复发作。已有研究证明TLR4/NF-κB通路在缺血性脑损伤、脑外伤、中枢神经系统感染、神经退行性疾病和脑自身免疫性炎症中发挥作用。在耐药性TLE，局灶性皮质发育不良和TSC患者的手术切除标本中发现TLR4蛋白的表达增高。动物实验发现，给予HMGB-1/TLR4蛋白抑制剂可以抑制癫痫的形成，提高癫痫发作的易感性。此外，TLR4敲除动物癫痫易感性性明显升高。在颞叶癫痫的动物模型中，抑制IL-1R1/TLR4途径可抑制癫痫发作。总之，TLR4信号通路为癫痫的的治疗提供了新的靶点。　　(-)表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是绿茶中最主要的多酚组分，它具有抗氧化，抗炎和抗凋亡的生物学特性。EGCG可以透过血脑屏障，在阿尔茨海默病，帕金森病，缺血性中风和脊髓损伤中起到了神经保护作用。EGCG可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的激活，对大鼠模型肾脏缺血再灌注损伤起到保护作用。在砷诱导的小鼠炎症和免疫毒性的影响研究中指出，EGCG可以抑制IL-1β、IL-6及TNF-α炎症因子分泌，减轻炎症反应。同时，EGCG可以改善酒精、脑缺血、糖尿病、铅中毒及应激反应等因素所导致的认知功能损伤，同样正常大鼠给予EGCG可以有效提高大鼠的认知功能。在唐氏综合Ⅱ期临床试验中发现长期应用EGCG可以改善唐氏综合征患者的认知功能。EGCG能否通过抑制TLR4通路以抑制颞叶癫痫发作，改善TLE认知障碍尚未有报道。　　本实验采用氯化锂-匹鲁卡品建立颞叶癫痫模型，观察EGCG对TLE发作及癫痫继发认知障碍中的神经保护作用，并对其中可能的机制进行了探讨，以期寻找到新的既能抑制癫痫形成，又能改善癫痫后认知功能障碍的新型药物。　　第一部分EGCG对氯化锂-匹鲁卡品诱导癫痫发作的影响　　目的：应用氯化锂-匹鲁卡品诱导颞叶癫痫模型，于癫痫持续状态(SE)后分别给予低、中、高剂量EGCG干预，通过评价大鼠SRS发作潜伏期，SRS发作比率，SRS发作频率及发作持续时间、脑电图(electroencephalogram, EEG)等指标，以探讨不同剂量EGCG对颞叶癫痫的保护作用。　　方法：　　成年健康雄性SD大鼠62只，随机选取52只制备大鼠SE模型。将成功制备的大鼠SE模型随机分成4组，模型组(EP)，依据SE后给予EGCG干预剂量不同分为EGCG低、中、高三组，即EP+EGCG12.5mg/kg组、EP+EGCG25mg/kg组及EP+EGCG50mg/kg组，每组10只，另设有正常对照组(Control)10只，总共5组。EGCG给药分别于SE后24h给予相应剂量腹腔注射，每日一次，连续给药28天。EP组给予相应的生理盐水腹腔注射。于SE后1周应用高清视频系统监测大鼠行为变化，记录大鼠SRS发作潜伏期，SRS发作频率及发作持续时间。于给药完毕后，监测各组大鼠脑电图变化。　　结果：　　1.52只用以诱发SE的大鼠，48只被诱发成SE，成功率为92.30％，8只在SE诱发成功后死亡，最终可纳入实验的大鼠共40只，将40只大鼠随机分为EP(n=10)及EP+EGCG12.5mg/kg(n=10)组、EP+EGCG25mg/kg(n=10)组及EP+EGCG50mg/kg(n=10)组。　　2.大鼠SRS发作潜伏期及发作率比较:EP组在SE后18.00±2.00天出现SRS发作，EP+EGCG12.5mg/kg在SE后(19.00±2.34)天出现SRS，EP+EGCG25mg/kg组出现SRS发作平均时间为(20.15±3.41),而EP+EGCG50mg/kg组出现SRS发作平均时间为(19.48±2.87)，四组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。EP组大鼠10只均出现SRS发作，SRS发生率达100%。EP+EGCG12.5mg/kg组有1只未出现SRS发作，SRS发作率达90%，EP+EGCG25mg/kg组有2只未出现SRS发作，SRS发作率达80%,EP+EGCG50mg/kg组有2只未出现SRS发作，SRS发作率达80%,四组间出现SRS发作比率差异无统计学意义(P＞0.05)。　　3.大鼠SRS发作频率及发作持续时间比较：与EP组SRS发作频率(2.11±0.09)相比，EP+EGCG12.5mg/kg组(1.62±0.10)、EP+EGCG25mg/kg组(1.00±0.08)、EP+EGCG50mg/kg组(1.02±0.05)SRS明显减少(P＜0.001)。并且EGCG中、高剂量组发作频率明显低于低剂量组(P＜0.001)，而EGCG中、高剂量两组无明显差异(P＞0.05)。EP组的平均癫痫发作持续时间较长(37.57±0.89s)，EP+EGCG(低、中、高)三组平均癫痫发作持续时间分别为(27.07±1.30、16.08±0.60s、15.24±0.85)，较EP组明显缩短(P＜0.001)。并且EGCG中、高剂量组发作时间明显低于低剂量组(P＜0.001)，而EGCG中、高剂量两组癫痫发作时间无明显统计学差异(P＞0.05)。SE后给与EGCG治疗可降低SRS发作频率和癫痫发作持续时间，EGCG中、高剂量效果明显优于低剂量组。　　4.慢性期大鼠脑电图变化：　　Control组大鼠脑电图以α或β节律为主，频率5-10Hz，波幅小于100uV。节律规则，脑电图记录过程中脑电波形基本一致而无过多变化，未出现棘波、棘慢波等异常波。EP组大鼠脑电图出现丛集样癫痫波，伴随间断棘波尖波慢波等癫痫波，大鼠IV/V自发作脑电图特点：发作时出现明显规律的丛集样癫痫波，首先变现为出现规律的频率约2Hz尖波，波幅约110uV，大鼠进入静止状态，随后尖波频率逐渐增快，波幅逐渐增大1mV，大鼠开始出现Ⅲ级发作，随着脑电放电频率增快，以θ或α节律放电，波幅增加达1mV，大鼠出现级V发作，同时脑电图极性发生改变，大鼠发作停止，脑电图出现发作后抑制状态。给予EGCG干预后，大鼠SRS发作次数减少，每次发作时间缩短，与脑电图显示癫痫放电相一致，给予EGCG后，丛集样放电较少，大鼠行为学发作多为IV级发作，出现V级次数明显减少，发作程度减轻。中剂量及高剂量EGCG干预组，脑电图表现发作时不易出现持续高尖波，很少出现发作后抑制。　　5.间期放电次数比较：随机选取非癫痫发作的10min的片段，每只大鼠选取5段，与EP组癫痫间期放电次数(37.27±2.00)相比，EP+EGCG12.5mg/kg组(30.53±2.18)、EP+EGCG25mg/kg组(18.27±1.87)及EP+EGCG50mg/kg组(17.00±6.12)间期放电次数明显减少(P＜0.001)。并且EGCG中、高剂量组发作频率明显低于低剂量组(P＜0.001)，而EGCG中、高剂量两组无明显差异(P＞0.05)。　　第二部分EGCG对氯化锂-匹鲁卡品癫痫大鼠认知功能障碍的影响　　目的：研究EGCG对癫痫大鼠认知功能、突触超微结构及相关突触蛋白的影响，进一步探讨相关的作用机制。　　方法：　　将健康成年雄性SD大鼠(n=35)，制备大鼠SE模型。依据第一部分实验结果，EGCG给药选择效果最好而用药最少的25mg/kg。将成功制备的大鼠SE模型随机分成2组，模型组(EP)，EGCG给药干预组(EP+EGCG)，每组10只，另设有正常对照组(Control)10只，总共3组。EGCG给药剂量及给药方式：25mg/kg，腹腔注射，于SE后24小时给予，每日一次，连续给药28天。EP组给予相应的生理盐水腹腔注射。根据文献报道及前期预实验，SE发作后多于14-42d出现SRS行为，由此我们选取SE发作后49d时，进行Morris水迷宫检测，检测完毕后行在体场电位记录(L-LTP)。电生理记录结束后行westernblot检测海马突触相关蛋白的表达，及透射电镜观察海马CA1区突触超微结构。　　结果：　　1.水迷宫检测：定位航行实验结果显示，每组大鼠的逃避潜伏期随着训练而缩短。三组的逃避潜伏期在前两天无统计学差异(P＞0.05)。在第3-5天，每组的逃避潜伏期短于前两天。与Control组相比，EP组大鼠的逃避潜伏期延长(P＜0.05)。EP+EGCG组大鼠的逃避潜伏期较EP组逃避潜伏期缩短(P＜0.05)。空间探索试验表明，EP组大鼠120s内穿越平台次数显著少于Control组(P＜0.01)。EP+EGCG组120s内平台穿越次数高于EP组(P＜0.01)，但仍与Control组有显着差异(P＜0.01)。EP组目标象限停留时间明显短于Control组(P＜0.01)。然而，EP+EGCG组大鼠目标象限的停留时间明显长于EP组大鼠(P＜0.01)。可视平台实验：各组大鼠逃避潜伏期无统计学差异(P＞0.05)。　　2.电生理记录结果:在体L-LTP,EP组其各个时间点fEPSP幅度显着低于Control组中的值(P＜0.001)。与EP组相比，EP+EGCG组的平均fEPSP幅度明显增加(P＜0.05)。　　3.海马CA1区超微结构：与Control组海马CAl区突触密度相比，EP组及EP+EGCG组突触密度明显减少(P＜0.001)。而EP+EGCG组突触密度较EP组明显增加(P＜0.001)。与Control组海马CA1区突触后致密物厚度比较，EP组及EP+EGCG组突触后致密物厚度明显变薄(P＜0.001)。而EP+EGCG组突触后致密物厚度较EP组明显增加(P＜0.001)。　　4.突触相关蛋白表达：与Control组大鼠相比，EP组大鼠海马中PSD95、SNAP25、Synaptophysin及Synaptotagmin1表达均显著降低(P＜0.01)。而EP+EGCG组PSD95、SNAP25、Synaptophysin及Synaptotagmin1表达较EP组明显升高(P＜0.01)。　　第三部分EGCG对氯化锂-匹鲁卡品癫痫大鼠神经保护作用及机制研究　　目的：研究EGCG与SE后给予干预，

摘要译文

关键词：

颞叶癫痫; 激活核转录因子; 4Toll样受体; 表没食子儿茶素没食子酸酯; 神经保护

学位年度：

2019

学位类型：

博士

学科专业：

神经内科学

导师：

王维平贾丽景

中图分类号：

R742.1[癫痫⑨]

学科分类号：

100210[神经病学]