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肺炎链球菌CiaR调控pbps和csRNAs基因表达作用及其与耐药相关性认领

作者：

张新蔚

学位授予单位：

温州医科大学

摘要：

背景：肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）是人类细菌性肺炎、中耳炎和脑膜炎常见病原体。β-内酰胺类抗生素是临床治疗肺炎链球菌感染性疾病的一线药物，但近年来该菌对β-内酰胺类抗生素耐药率不断升高。β-内酰胺类抗生素能与细菌表面青霉素结合蛋白（penicillin-binding proteins，PBPs）共价结合，使细菌细胞壁合成受阻而导致裂解。早已证实，PBPs突变可使其与β-内酰胺类抗生素亲和力下降，从而出现对β-内酰胺类抗生素的耐药性。尔后发现，PBPs未突变肺炎链球菌也可对β-内酰胺类抗生素耐药，但机制不明。有文献报道，肺炎链球菌二元信号传导系统（two-component signaling system，TCSS）CiaH/CiaR与β-内酰胺类抗生素耐药相关，生物信息学预测结果显示肺炎链球菌有5个microRNA基因为 CiaR靶基因，并将该 microRNAs命名为 cia-依赖小 RNAs（cia-dependent small RNAs，csRNAs）。我们以往研究也发现，肺炎链球菌CiaH/CiaR-TCSS中的CiaH与β-内酰胺类抗生素耐药性有关。近年文献报道，细菌microRNAs也能在转录后水平调控基因表达。因此，CiaR有可能直接或通过csRNAs介导PBPs未突变肺炎链球菌对β-内酰胺类抗生素耐药性。　　目的：采用生物信息学软件预测肺炎链球菌5个microRNAs与pbps-mRNAs相互结合的序列或位点，为今后实验研究microRNAs与pbps-mRNAs之间相互作用的提供依据。了解青霉素（PCN）和头孢噻肟（CTX）对肺炎链球菌microRNAs与pbps-mRNAs表达的诱导作用。构建肺炎链球菌ciaR基因敲除突变株（ΔciaR），通过ΔciaR突变株和野生株比较，了解肺炎链球菌CiaH/CiaR二元信号传导系统中反应调节蛋白 CiaR对青霉素结合蛋白基因（pbps）和 cia-依赖小 RNA基因（csRNAs）表达的调控作用以及耐药性变化。　　方法：采用RNA-RNA相互作用的专用分析软件IntaRNA（Interacting RNAs）预测肺炎链球菌csRNAs与pbps-mRNAs相互结合的序列或位点。构建用于敲除肺炎链球菌ciaR基因的自杀质粒pEVP3ciaR，通过自杀质粒同源交换、插入失活及氯霉素筛选获得ΔciaR突变株。采用PCR及其产物测序鉴定ΔciaR突变株。采用生长曲线测定法了解肺炎链球菌ΔciaR突变株及其野生株的生长情况并进行比较。采用E-test测定青霉素（PCN）和头孢噻肟（CTX）对肺炎链球菌ciaR突变株（ΔciaR）和野生菌株最低抑菌浓度（MIC）。采用实时荧光定量RT-PCR，检测ΔciaR突变株及其野生株1/4 MIC PCN或CTX作用前后pbps-mRNAs和csRNAs水平变化与差异。　　结果：IntaRNA预测结果显示，肺炎链球菌csRNAs与pbps-mRNAs存在相互结合的序列或位点。肺炎链球菌ΔciaR突变株PCR及其产物测序结果证实，ΔciaR突变株中 ciaR基因被插入失活而敲除，但生长曲线测定结果显示，ciaR突变株及其野生株的ΔciaR突变株与野生株生长曲线基本一致。1/4 MIC PCN或CTX作用后，肺炎链球菌ΔciaR突变株pbps-mRNAs水平明显升高（P＜0.05）、csRNAs水平明显降低（ P＜0.05），但其野生株 pbps-mRNAs水平明显降低（P＜0.05）、csRNAs水平明显升高（P＜0.05）。E-test结果显示，PCN和CTX对ΔciaR突变株MIC均较野生株增加250倍。　　结论：肺炎链球菌CiaR通过上调csRNAs表达在转录后水平抑制PBPs表达可能是该菌对PBPs突变无关PCN和CTX耐药性增强的机制之一。

摘要译文

关键词：

肺炎链球菌; 基因表达; 耐药性

学位年度：

2017

学位类型：

硕士

学科专业：

临床检验诊断学

导师：

孙爱华

中图分类号：

R378.14;R378.1[球菌]

学科分类号：

100103[病原生物学];100601[中西医结合基础医学]