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亮甲酚蓝（BCB）染色法预测牛卵母细胞未来发育能力的研究认领

被引量： 4

作者：

乔利敏

学位授予单位：

甘肃农业大学

摘要：

卵丘-卵母细胞复合体(COCs)作为胚胎体外生产的重要元件,其体外成熟(IVM)的质量是影响胚胎体外生产(IVEP)的关键因素之一,直接影响着卵母细胞的激活、受精及随后的胚胎发育能力。目前,胚胎生物技术研究主要是从屠宰场收集卵巢,由于卵巢的拣取、卵母细胞筛选的盲目性以及许多其它的因素,特别是卵母细胞的核质成熟存在着明显的不同步性,导致体外胚胎生产的效率仍然很低。利用卵母细胞体外成熟技术,可获得大量的廉价卵母细胞,既克服了超数排卵技术的局限性,又满足了胚胎工程技术发展的需要。本文以组织培养液199(TCM199)为基础培养基就牛未成熟卵母细胞经亮甲酚蓝(BCB)选择后对其体外成熟-体外受精-核移植(IVM-IVF-NT)的影响进行了研究,并且检测了卵母细胞成熟前后谷胱甘肽(GSH)的浓度,从而探索了一种较理想的筛选高质量卵母细胞的方法,在此基础上进一步研究了表皮生长因子(EGF)、β-巯基乙醇(β-ME)、亚硫磺酸(HTAU)对牛卵母细胞IVM-IVF-NT发育能力影响的研究,进而优化体外培养体系,以满足胚胎工程研究及生产性胚胎移植的需要,实现良种家畜胚胎的工厂化生产,加速畜牧业的发展。实验结果表明: 1.牛未成熟卵母细胞经过13,26,39,52μmol/L的BCB染色90min后,其中用26,39,52μmol/L的BCB染色的BCB+组所占的百分率(27.7%,27.6%,31.9%)较13μmol/L的BCB染色后所占的百分率(2.1%)差异显著;并且染色后BCB+组间的成熟率差异不显著(P>0.05),其中BCB+组(77.4%)较BCB-组(51.3%)和对照组(60.2%)的成熟率差异显著(P<0.05),并且以26μmol/L BCB染色选择COCs最佳;通过26μmol/L BCB染色90min后,COCs在IVM-IVF-NT后BCB+组的囊胚率和囊胚细胞数最高并且较对照组、BCB-组差异显著(P <0.05)。从而证明BCB染色可以被用来有效的选择成熟前不同发育活性的牛卵母细胞。BCB染色本身不能提高MII期卵母细胞的成熟率和体外受精率,但有助于选择体外成熟以前有发育活性的卵母细胞。 2. COCs在经26μmol/L BCB染色90min后,试验结果显示对照组和处理组在成熟培养前后谷胱甘肽的浓度(unstained组,3.801034,7.418366 pmol/cell;BCB-组,3.51179,7.291422 pmol/cell;BCB+组,5.044247,11.26002 pmol/cell)差异显著(P<0.05);其中BCB+组较对照组和BCB-组中谷胱甘肽的浓度差异显著(P<0.05)。试验结果表明成熟后卵母细胞中GSH浓度大约是未成熟前卵母细胞中GSH浓度的2倍,而且经选择后的BCB+组卵母细胞成熟质量更高,有利于胚胎的后期发育。 3.经BCB染色后卵母细胞在成熟后的凋亡情况不一样。其中BCB+组的成熟率、凋亡率(80.9%,6.4%)较对照组(60.2%,27.6%)、BCB-组(51.9%,38.6%)差异显著(P<0.05)。表明随着卵母细胞发育潜能的降低其凋亡率逐渐升高。 4.三种化学激活方法Ionomycin +6-DMAP、A23187 +6-DMAP与乙醇+6-DMAP均能激活牛孤雌胚,使其发育;三种激活的方式均不能时间过长,以5 min效果较好,时间过长容易造成细胞碎裂;其中以Ionomycin +6-DMAP组激活效果较好。 5.试验表明BCB染色对未成熟卵母细胞质量的选择以及培养体系对SCNT效果的影响。得出结论:牛卵母细胞成熟培养前通过BCB染色可以选择不同发育能力的卵母细胞,从而为IVM-IVF的研究和体细胞核移植的成功率提供高质量的COCs;在核移植中,受体卵母细胞的选择以卵母细胞成熟前进行BCB染色为依据,以BCB+组作为受体卵母细胞,在成熟液中添加50 ng/mL EGF和100μmol/Lβ-ME,在核移植后重组胚培养液中添加0.5 mmol/L HTAU,其囊胚率32.26%较对照组不进行BCB染色不采用优化培养体系提高了79.22%,表明它是提高牛IVM-NT效率的优化体系。

摘要译文

关键词：

牛; 卵母细胞; 体外成熟; 胚胎培养

学位年度：

2009

学位类型：

硕士

学科专业：

动物遗传育种与繁殖

导师：

关伟军

中图分类号：

S823[牛⑨]

学科分类号：

0905[畜牧学]

D O I：

10.7666/d.y1558825