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根癌农杆菌介导的盾叶薯蓣转化体系的建立认领

被引量： 10

作者：

范俊强

学位授予单位：

华中农业大学

摘要：

盾叶薯蓣（Dioscorea zingiberensis C.H.Wrigh t）,是我国特有的甾体激素类药源植物,也是世界上薯蓣皂甙元含量最高的资源植物。近些年,由于人类的过度采挖,野生盾叶薯蓣资源濒临枯竭,而人工栽培种存在皂甙元含量降低,种质退化等问题。细胞和基因工程技术可望为盾叶薯蓣的品种改良提供一个新的途径。本实验筛选了盾叶薯蓣易组织培养的基因型,并以其三种外植体—幼胚诱导的胚性愈伤,花序愈伤和花序作为转化受体,研究了根癌农杆菌介导的盾叶薯蓣转化的各种影响因素,获得了转基因植株,初步建立了根癌农杆菌介导的盾叶薯蓣转化体系,为通过转基因技术对其进行品种改良的研究奠定了技术基础。主要研究结果如下: 一、转化受体的准备 1.基因型筛选。利用盾叶薯蓣四种基因型的幼胚进行了愈伤诱导实验,结果表明:不同基因型的组织培养能力不同,田间编号为4—73的材料最易进行组织培养,幼胚愈伤诱导率最高,达95.3%;其次是4—61,诱导率为91.2%;然后是5—88,诱导率为76.3%;4—72几乎没有诱导出愈伤。选择最容易组织培养的4-73作为以后研究的材料。 2.幼胚来源的愈伤继代和状态改良。4-73的幼胚诱导出来的初代愈伤,不成颗粒,生长缓慢,而且水浸状严重,再生困难,难以直接进行转化研究。通过调节激素种类与浓度、基本培养基成分,有机添加物,改变继代方式等,经过长时间的改良后,产生了白黄色,致密,表面呈颗粒的胚性愈伤。 3.花序愈伤诱导。取4-73幼嫩的花序,在MS附加0.5 mg/L 2,4-D,1.0 mg/L 6-BA或0.2 mg/L 2,4-D,1.0 mg/L 6-BA两种培养基上,均能诱导出高质量的愈伤。二、影响转化的主要因素研究 1.外植体类型对转化的影响。利用4-73幼胚来源的胚性愈伤、花序诱导的愈伤以及花序三种外植体,分别与农杆菌共培养后,比较GFP的瞬间转化率。幼胚来源的胚性愈伤转化率最高,达到49.3%;花序愈伤转化率次之,达到40.5%;花序的瞬间转化率最低,只有5.5%,不适合直接作为转化的受体。 2.预培养对转化的影响。分别用幼胚来源的胚性愈伤和花序愈伤两种外植体作为转化受体,比较预培养与否时,GFP的瞬间转化率。结果表明:两种外植体经过预培养均比不经过预培养时转化率要高,预培养对转化有利。 3.预培养基和共培养基成分对转化的影响。通过MS,1/4MS和去掉CaCl2的MS三种基本培养基作为预培养和共培养基。结果发现,去掉CaCl2的MS最适合用作预培养和共培养的基本培养基。 4.AS对转化的影响。通过是否添加200μmol/L AS时的GFP瞬间转化率比较,发现预培养和共培养阶段,培养基中添加200μmol/L AS有利于提高转化率。 5.农杆菌浸染浓度对转化的影响。分别用OD600为0.3,0.5,0.8的农杆菌浸染液,感染胚性愈伤后,比较GFP瞬间转化率,结果显示,盾叶薯蓣转化的最佳菌液浓度为OD600=0.5。 6.共培养时间对转化的影响。用幼胚胚性愈伤作为受体,分别统计共培养1 d、2 d、3 d、4 d后,GFP的瞬间转化率。结果表明,共培养3 d时瞬间转化率最高。 7.转化参数的验证。以幼胚胚性愈伤和花序愈伤为受体,利用含有GUS报告基因载体的农杆菌EHA105介导,按照以上得出的转化参素进行转化,验证转化参数是否合适。结果显示:两种受体共培养后,经过GUS染液染色过夜,在大部分外植体上都观察到蓝斑,从而验证了前面得出的转化参数是正确的。三、转化细胞的筛选、扩繁和再生,以及转基因植株PCR的鉴定 1.潮霉素筛选浓度的确定。将胚性愈伤转到含有潮霉素9个浓度梯度的培养基上,生长1个月后,观察愈伤在各个浓度上的生长状态,以确定潮霉素的筛选浓度。结果显示:在盾叶薯蓣转化实验中,合适的潮霉素筛选浓度为70mg/L。 2.转化细胞的筛选、扩繁和再生。共培养后,将各外植体转到响应的筛选培养基上,经过1-2个月的筛选,只有幼胚来源的胚性愈伤作为受体,进行转化后,产生了抗性愈伤,抗性愈伤在不含抗生素的培养基上扩繁两次,在再生培养基上分化出8棵拟转化苗。 3.转基因植株的GFP绿色荧光表达检测。将上面所得的拟转化苗进行扩繁后,在荧光体式显微镜下观察,发现在叶和叶柄上有微弱的绿色荧光表达。 4.转基因植株的PCR鉴定。提取扩繁后拟转化苗的总DNA,用潮霉素引物扩增出了潮霉素基因片段,说明筛选过程是严谨的,获得了转化的转基因植株。

摘要译文

关键词：

盾叶薯蓣; 胚性愈伤; 农杆菌介导的转化; GFP瞬间表达; PCR

学位年度：

2008

学位类型：

硕士

学科专业：

植物学

导师：

姚家玲

中图分类号：

S567.239;S567.23[多年生⑨]

学科分类号：

0901[作物学];100810[分子生药学]

D O I：

10.7666/d.y1394464