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应用基因工程技术优化必特螺旋霉素组分认领

作者：

马春燕

学位授予单位：

沈阳药科大学

摘要：

必特螺旋霉素(BT)是利用基因工程技术对螺旋霉素(SP)的碳霉糖4″-羟基进行酰化获得的以4″异戊酰SP为主组分的新抗生素，组分比较复杂，原因有两个：首先是SP本身有三个组分(SPⅠ、SPⅡ和SPⅢ)，其次是异戊酰化SP的异戊酰基转移酶特异性有限。本论文从减少SP组分数量入手，实现减少BT组分的目的，为今后简化BT提取工艺、推进产业化做出贡献。在SP三个组分中，SPⅡ和SPⅢ是SPⅠ分别乙酰化和丙酰化的产物，并且由同一个酶(3-O-酰基转移酶，编码基因称为sspA)催化完成。因此，如果将该酶基因替换为酰化效率和酰化专一性更高的酶基因，可以显著减少SP的组分数量；如果将该酶基因破坏，则SP由三个组分变为一个组分(SPⅠ)，也将显著减少SP的组分数量。本论文正是围绕这种构思进行。实施上述构思均需要利用DNA同源双交换技术，以实现基因阻断或基因替换的目的。因此，获得SP生物合成中的sspA基因及其侧翼序列是必需的。麦迪霉素、碳霉素与SP的结构非常相似。我们根据碳霉素和麦迪霉素生物合成中的3-O-酰基转移酶(3-O-AT)序列，设计了简并性PCR引物，以SP产生菌S. spiramyceticus F21总DNA为模板，PCR扩增获得了一段878bp DNA序列；接着，采用SON-PCR(single oligonucleotide nested PCR)方法，获得了sspA基因完整ORF及其侧翼序列，共约4.3kb。我们采用DNA同源双交换技术对SP产生菌S. spiramyceticus F21中的sspA进行了删除。sspA缺失变株发酵产物分析表明其主要组分为SPⅠ(原株主要组分为SPⅡ和SPⅢ)；但是SP的发酵效价也下降了约90％，原因尚不清楚。麦迪霉素的16元内酯环3位羟基均被丙酰化，我们推测其生物合成中的3-O-AT(MdmB)具有较高的酰化效率和丙酰化特异性；因此，我们将mdmB基因替换SP产生菌中的sspA基因，希望获得单组分SPⅢ。基因替换变株发酵产物分析表明其中仍存在SPⅠ、SPⅡ和SPⅢ组分，说明mdmB基因的高酰化效率和丙酰化特异性与麦迪霉素产生菌本身具有紧密的联系。依据上述实验结果，我们减少BT组分的策略为：对BT基因工程菌中的sspA基因进行阅读框架内部分序列删除操作，在实现sspA基因失活、导致菌株只能产生SPⅠ组分的同时，尽量不影响菌株的SP产生潜力，从而获得有效地简少BT组分数量的基因工程菌。sspA基因阅读框架内部分序列(612bp，占整个基因大小的50％)删除的新BT产生菌发酵产物分析表明，原BT组分中的的两个主要组分——异戊酰SPⅡ和异戊酰SPⅢ已经消除。我们成功地获得了以异戊酰SPⅠ为主要组分的BT新基因工程菌。

摘要译文

关键词：

必特螺旋霉素; 异戊酰基转移酶; 单引物巢式PCR; 异戊酰螺旋霉素I

学位年度：

2007

学位类型：

硕士

学科专业：

微生物与生化药学

导师：

王以光

中图分类号：

R91[药物基础科学]

学科分类号：

100603[中西医结合药学];1007[药学]