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新型重组环状胸腺五肽结构类似物cyclo-（Cys-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-）的研制认领

作者：

高媛

学位授予单位：

暨南大学

摘要：

胸腺五肽(thymopoietin pentapcptide，TP-5)是胸腺生成素Ⅱ(Thymopoieti-n Ⅱ)上的活性中心第32位～36位氨基酸序列(-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-)，具有胸腺生成素Ⅱ的全部生理功能，是具有重要免疫调节功能和极具应用价值的药物多肽。目前，临床应用的TP-5为化学合成的线状多肽，存在半衰期短，体内稳定性差，易被蛋白酶降解等问题，严重限制了其在临床上的应用。为提高多肽的活性和稳定性，本研究首次尝试采用基因工程手段，将蛋白内含肽可诱导剪切功能和非保护多肽硫酯环合技术相结合，实现新型重组环状胸腺五肽结构类似物cyclo-(Cys-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-)[以下简称cTP]的制备。cTP属于六肽环，其线性前体的结构设计是在胸腺五肽序列的N端添加了一个半胱氨酸残基。与线性多肽相比，活性环肽由于主链呈环状结构，具有一定的构象约束作用，使其构象更加稳定；由于没有所谓氨基端和羧基端，其抗酶解能力强于线性多肽。因此理论上环肽cTP比线性肽TP-5具有更高的生物利用度与更强的生物活性，更具有药用开发价值。试验设计并合成编码6个氨基酸的cTP线性前体基因，克隆到表达载体pTWIN1，重组表达质粒pTW-cTP转化E．coli ER2566构建工程菌cTP-ER2566，IPTG诱导实现由几丁质结合域纯化标签(Chitin binding domain，CBD)、2个蛋白内含肽和目的多肽组成的“多元”融合蛋白(CBD-Inteinl-cTP-Intein2-CBD)的表达。在实验室水平优化工程菌cTP-ER2566的发酵参数。初步的探索结果表明：1％甘油作为碳源，培养菌体密度至A600达到0.5-1.0时加入IPTG至工作浓度0.4mmol／L，30℃诱导表达3-4h，可保证目的融合蛋白的可溶性高效表达。以实验室研究为参考，利用5L发酵罐发酵，3L发酵液收获湿菌102g，其中目的融合蛋白表达量达到33—35％，可溶性成分占可溶性总蛋白的29％。几丁质柱亲合层析纯化融合蛋白后，改变pH值和温度诱导inteinl在其C端切割，硫醇试剂——巯基乙磺酸(MESNA)诱导intein2在其N端切割，释放出N末端为Cys，C端具硫酯键的重组cTP线性硫酯前体，通过非保护多肽硫酯环合实现环肽生成。激光飞行质谱结果显示纯化产物的分子量为764.4Dal，与环肽的理论值相符，环化效率初步检测达到95％以上。免疫活性检测结果显示，环肽cTP较线性多肽TP-5具有更显著的促进巨噬细胞吞噬能力的活性(P＜0.01)和促进B细胞抗体生成

摘要译文

关键词：

重组环肽; 蛋白内含肽; 非保护多肽硫酯环合

学位年度：

2006

学位类型：

硕士

学科专业：

遗传学

导师：

洪岸

中图分类号：

Q789[基因工程的应用]

学科分类号：

071005[生物化学与分子生物学];071007[遗传学];083601[基因工程]