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抗菌肽自组装水凝胶用于龋病预防及治疗研究认领

作者：

魏佳琦

学位授予单位：

兰州大学

摘要：

目的:龋病的发生机制与变异链球菌(S.mutans)主导的菌斑生物膜介导的酸性微环境密切相关,其核心病理过程表现为牙体硬组织脱矿。本研究针对当前防龋策略的局限性,基于抗菌肽(AMPs)独特的抗菌特性——兼具高效抗微生物活性、生物可降解性及低耐药诱导特性,旨在开发一种可自组装成胶的抗菌肽。通过体外-体内实验体系,系统评估该抗菌肽对于致龋菌生长、菌斑生物膜形成及龋损进展的干预效果,为解决龋病管理中传统剂型应用受限问题提供新型治疗策略。方法: (1)采用Fmoc固相多肽合成法合成抗菌肽,利用高效液相色谱仪进行多肽纯化并进行质谱鉴定;通过最小抑菌浓度(MIC)测定、最小杀菌浓度(MBC)测定、杀菌动力学曲线拟合、抗菌后效应(PAE)检测和细菌生物膜形成抑制等实验对抗菌肽的体外抗菌活性进行研究;借助扫描电镜(SEM)、碘化丙啶(PI)流式细胞术等研究抗菌肽对于细菌细胞膜的破坏作用;通过CCK-8细胞活力检测、LDH释放实验、溶血毒性及唾液稳定性实验评价抗菌肽的体外生物安全性。 (2)采用控制变量法探究抗菌肽形成水凝胶的最适条件,利用核磁滴定法阐明其成胶机制;采用SEM表征微观形貌,流变仪测定机械性能;并通过可注射性、体外降解动力学来评估其临床适用性;采用高效液相色谱(HPLC)定量分析凝胶缓释性能;采用流式细胞术检测细菌活性氧(ROS)水平揭示抗菌机制;采用CCK-8、LDH检测、溶血毒性和细胞活/死染色评价其体外生物安全性。 (3)构建大鼠龋齿模型,分别考察抗菌肽水溶液或水凝胶对大鼠龋病的预防作用或早期龋病的抑制作用,利用荧光素钠表征抗菌肽水溶液或水凝胶在口内的持久性;利用体视显微镜记录龋损进展,结合16S-r RNA基因测序分析口腔菌群结构变化;并通过Micro-CT三维重建技术评估抗菌肽水凝胶对大鼠早期龋损的抑制效果;系统监测脏器结构及血液生化指标等以验证体内生物安全性。结果: (1)依据目标序列(RRRWRWRIGIRIY)成功合成并纯化抗菌肽A3,质谱检测其分子量与理论分子量(1887.24 Da)高度吻合;A3对S.mutans表现出特异性抑制作用(MIC=16μM,MBC=4×MIC),杀菌动力学曲线和PAE结果显示A3对于S.mutans的抑制作用具有高效性和持久性,且显著抑制细菌生物膜的形成;A3作用8 h后S.mutans形态显著皱缩,流式检测PI峰值右移;CCK-8结果显示A3对于L929细胞无明显细胞毒性,溶血率与阴性对照组相当,HPLC结果显示抗菌肽在唾液环境中稳定性较好。 (2)形成A3抗菌肽自组装水凝胶(A3-SAG)的抗菌肽最适浓度为5 m M,PBS的浓度为8 m M,其机制主要为抗菌肽与PBS中的磷酸根离子交联成胶;A3-SAG在扫描电镜下呈现多孔三维网络结构,且具有良好的可注射性能和体外降解性能,在酸性条件下降解速度更慢;A3-SAG在唾液中具有缓释现象,其浸出液可通过促进细菌内ROS生成发挥其抗菌活性,且具有较好的生物安全性。 (3)动物实验结果显示A3溶液和A3-SAG在大鼠口腔内滞留时间均超过1h,A3溶液局部涂布后,大鼠龋病发病率明显低于模型对照组,其浓度为4MIC时对龋病的预防效果最佳;通过致龋饲料及蔗糖水喂养,成功构建大鼠早期龋病模型,随后给予A3-SAG局部涂布,Micro-CT结果显示实验组大鼠龋损程度再无明显进展,釉质脱矿程度较对照组更低;大鼠脏器指数、器官组织切片及血液生化指标均无统计学差异。结论: 本研究设计了一种可自组装成胶型抗菌肽A3,其溶液及凝胶态均具有优良的抗菌性能和生物相容性,在致龋环境中能够显著抑制龋病的发生及发展,为临床上龋病的预防及早期抑制提供了安全且有前途的解决方案。

摘要译文

关键词：

龋病; 抗菌肽; 抗菌肽自组装水凝胶; 变异链球菌; 菌斑生物膜

学位年度：

2025

学位类型：

硕士

学科专业：

口腔医学（专业学位）

导师：

阎文锦

中图分类号：

R781.1[龋齿⑨]

学科分类号：

1002[临床医学];100302[口腔临床医学]

D O I：

10.27204/d.cnki.glzhu.2025.002851