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褪黑素在小鼠脊髓背角神经元发挥镇痛效应的受体机制研究认领

作者：

杨银娟

学位授予单位：

中国人民解放军空军军医大学

摘要：

目的:神经病理性痛(neuropathic pain,NP)是由躯体感觉系统的损害或疾病引起的,属于一种慢性痛,有感觉异常,痛觉过敏等症状。其发病率逐年增加,严重影响患者生活质量,且发生发展机制尚不明确。目前的治疗药物主要是阿片类药物,但是其副作用大,难以在临床实践中广泛应用。以往研究表明,褪黑素(melatonin,MLT)能够作用于背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)减轻NP大鼠的痛觉过敏,且选择性MLT 2型受体(melatonin receptor 1B,MT2)激动剂通过调控脑干下行痛觉通路发挥镇痛效应,但其在脊髓水平的研究鲜少报道。本课题主要研究NP状态下,MLT是否在脊髓水平参与镇痛效应的调节及其可能的受体机制,以期未来能够研制出更好的靶向镇痛药物,为更多的疼痛患者解除痛苦,提高生活质量。方法:1.采用雄性C57BL/6小鼠,建立坐骨神经部分损伤(spared nerve injury,SNI)模型,鞘内注射MLT以及MLT受体的激动剂和/或拮抗剂,运用von Frey纤维丝测试比较SNI组和假手术(Sham)组小鼠给药前后机械刺激缩足反应阈值(paw withdrawal mechanical threshold,PWMT)的变化;采用热板实验(hot plate test)比较SNI组和Sham组小鼠给药前后缩足潜伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL)的变化。共分为9组:(1)SNI+Saline;(2)SNI+MLT;(3)SNI+MLT 2型受体激动剂(8MP);(4)SNI+MLT 1型和2型受体激动剂(Ramelteon);(5)SNI+Ramelteon+褪黑素2型受体拮抗剂(4PP);(6)Sham+Saline;(7)Sham+MLT;(8)Sham+8MP;(9)Sham+Ramelteon。 2.以C57BL/6小鼠、GAD67-GFP转基因小鼠和vGluT2-Cre:Ai9转基因小鼠为研究对象,采用免疫荧光染色技术明确脊髓背角不同类型神经元、小胶质细胞及星形胶质细胞上MT2的表达分布情况。以SNI术后7 d C57BL/6小鼠为研究对象,采用原位杂交技术明确脊髓背角MT2阳性兴奋性神经元表达FOS蛋白的情况;以SNI术后7 d GAD67-GFP转基因鼠为研究对象,采用免疫荧光染色技术明确脊髓背角MT2阳性抑制性神经元表达FOS蛋白的情况。 3.通过膜片钳技术,比较SNI、Sham造模后8MP干预前后,脊髓背角MT2兴奋性神经元兴奋性的改变。观察的主要指标有:动作电位基强度,静息电位及兴奋性突触后电流的频率和幅度等。 4.采用行为药理学的策略观察SNI小鼠鞘内注射MLT及其受体激动剂后神经病理性痛相关焦虑样行为的变化,使用的实验方法有旷场实验(open field test,OFT)及高架十字迷宫实验(elevated plus maze,EPM)。利用旷场实验观察SNI、Sham小鼠鞘内给药后旷场相关指标(活动总路程、进入旷场中央的时间)的变化以评价该药物对焦虑样负性情绪的影响。利用高架十字迷宫实验观察SNI、Sham小鼠鞘内给药后高架相关指标(在开放臂的路程、在开放臂活动的时间占总时间的百分比)的变化以评价该药物对焦虑样负性情绪是否有改善作用。结果:1.与Sham组相比,SNI组小鼠的PWMT显著降低(P<0.05);鞘内给予MLT、8MP和Ramelteon均能显著恢复SNI组小鼠降低的PWMT(P<0.05);SNI组小鼠同时给予Ramelteon+4PP后PWMT无显著变化(P>0.05);Sham组小鼠鞘内给予MLT、8MP及Ramelteon后PWMT无显著变化(P>0.05)。与Sham组相比,SNI组小鼠在48℃、52℃及56℃下的PWTL无显著变化(P>0.05),且MLT及其受体激动剂给药前后均无明显差异(P>0.05)。 2.免疫荧光染色结果表明,在C57BL/6小鼠脊髓背角处,神经元标记物Neu N与MT2大量共标,占比高达94.67%±1.1%;在vGluT2-Cre:Ai9转基因小鼠脊髓背角处,MT2与表达td Tomato红色荧光蛋白的vGluT2(兴奋性神经元标记物)共标率达56.83%±1.38%;在GAD67-GFP转基因小鼠脊髓背角处,MT2和表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的GAD67(抑制性神经元标记物)也存在部分共标,共标率仅有29.17%±1.85%。而MT2和小胶质细胞标记物离子钙接头蛋白1(ionized calcium-binding adapter molecule 1,Iba1)、星形胶质细胞标记物胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)尚未观察到明确的共标。原位杂交结合免疫荧光染色结果表明:SNI术后7 d C57BL/6小鼠脊髓背角处的MT2阳性兴奋性神经元和FOS蛋白有共标,共标率为31.08%±1.38%;免疫荧光染色结果表明:SNI术后7 d GAD67-GFP转基因小鼠MT2阳性抑制性神经元与FOS蛋白有少量共标的情况,共标率为6.43%±0.24%。 3.膜片钳结果表明:与Sham组相比,SNI组脊髓背角兴奋性神经元的动作电位基强度明显降低(P<0.05);静息电位绝对值减小(P<0.05);并且8MP可以逆转上述变化(P<0.05)。SNI组给予8MP后MT2阳性兴奋性神经元的兴奋性突触后电流(spontaneous excitatory postsynaptic currents,s EPSC)的频率也降低(P<0.05),而幅度无明显变化(P>0.05)。同时,Sham组8MP给药前后脊髓背角兴奋性神经元的基强度和静息电位绝对值无明显变化(P>0.05)。 4.旷场实验结果显示:SNI术后12 w小鼠进入旷场中央的时间减少(P<0.05);高架十字迷宫实验结果显示:SNI术后12 w小鼠在开放臂的路程、在开放臂活动的时间占总时间的百分比下降(P<0.05),表现出焦虑样行为。鞘内给予MLT、8MP或Ramelteon并不能缓解焦虑样行为:给药后小鼠的活动总路程、进入旷场中央的时间、在开放臂的路程以及在开放臂活动的时间占总时间的百分比均无明显变化(均P>0.05)。结论:1.SNI小鼠的PWMT而不是PWTL显著降低,说明小鼠出现机械痛敏而没有热痛敏。MLT及其受体激动剂显著增加SNI小鼠降低的PWMT,表现出对于机械痛的镇痛效应,且该效应是通过MT2介导的。 2.MT2广泛分布于小鼠脊髓背角神经元的胞膜上,尤其是兴奋性神经元,在抑制性神经元也有少量分布,小胶质细胞、星形胶质细胞尚未观察到MT2的分布。在神经病理性痛状态下脊髓背角MT2阳性兴奋性神经元活化,MT2阳性抑制性神经元可能被活化。 3.SNI术后小鼠脊髓背角兴奋性神经元的兴奋性增强。8MP通过激活MT2可以逆转SNI组神经元降低的基强度和静息电位绝对值,从而降低脊髓背角神经元异常增高的兴奋性。同时,8MP也减少SNI小鼠突触前兴奋性神经递质的释放,但不改变突触后受体的表达。 4.SNI术后12 w,小鼠表现出显著焦虑样行为,但鞘内给予MLT及其受体激动剂对焦虑样行为无明显改善作用。

摘要译文

关键词：

神经病理性痛; 褪黑素; 褪黑素2型受体; 脊髓背角神经元

学位年度：

2025

学位类型：

硕士

学科专业：

人体解剖与组织胚胎学

导师：

陈涛王盼

中图分类号：

R741[神经病学⑨]

学科分类号：

100210[神经病学]

D O I：

10.27002/d.cnki.gsjyu.2025.000302