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葡萄根际木霉的筛选及长枝木霉LT9对葡萄根腐病生防机理研究认领

作者：

杜化迎

学位授予单位：

宁夏大学

摘要：

葡萄根腐病是国内外公认的葡萄上的毁灭性病害,对葡萄产量和品质产生了大量的负面影响。为研发出防治该病害的生防制剂,本研究从五个健康酿酒葡萄园的植株根际土壤中分离获得71个木霉菌,结合课题组保存的4株木霉菌,共75株作为试验材料。通过平板对峙培养、发酵滤液抑菌和挥发性物质抑菌试验,结合菌株生物学特性分析,筛选获得一株对葡萄根腐病病原菌锐顶镰刀菌(Fusarium acuminatum)FAC-17生防效果良好且抗逆性强的木霉菌株。进一步通过盆栽试验验证了最佳生防菌株长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)LT9对葡萄根腐病的防治效果,并利用宏基因组学和转录组学技术,从微生物群落结构和分子水平揭示了其对葡萄根腐病的生防机理。主要研究结果如下: (1)从宁夏5个酿酒葡萄园采集的土壤样品中共分离到71株木霉,通过形态鉴定和分子生物学分析,确定其分别属于长枝木霉(T.longibrachiatum)、深绿木霉(T.atroviride)、贵州木霉(T.guizhouense)、短密木霉(T.brevicompactum)、深褐木霉(T.atrobrunneum)、非洲哈茨木霉(T.afroharzianum)、绿木霉(T.virens)7个种。对分离获得的71株木霉菌和课题组保存的4株木霉菌(侧耳木霉T.pleuroticola TPL1、钩状木霉T.hamatum THA2、棘孢木霉T.asperellum bai5、棘孢木霉T.asperellum TAS4)进行初步拮抗抑菌效果筛选后,从每种木霉菌中选取抑菌效果最好的1～3株进行后续试验,最终确定的12株木霉菌株为长枝木霉LT9、深绿木霉TA12、贵州木霉TG19/TG33/TG57、深褐木霉TA27、非洲哈茨木霉TA32、绿木霉TV50、棘孢木霉bai5、侧耳木霉TPL1和钩状木霉THA2。 (2)为综合评估12株木霉的生防潜力及其对不良环境的耐受能力,测定了这些菌株对9株病原菌的抑菌效果,包括燕麦镰刀菌FAV-7(Fusarium avenaceum)、木贼镰刀菌FEQ-10(Fusarium equiseti)、锐顶镰刀菌FAC-11(Fusarium acuminatum)、厚垣镰刀菌FCH-13(Fusarium chlamydosporum)、三线镰刀菌FTR-14(Fusarium tricinctum)、尖孢镰刀菌FOX-15(Fusarium oxysporum)、茄病镰刀菌FSO-16(Fusarium solani)、小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)NPA-Y1、锐顶镰刀菌(F.acuminatum)FAC-17。同时,测定了各菌株的生长速度、耐盐碱能力、耐营养胁迫能力,并评估了其产吲哚乙酸(IAA)、蛋白酶、铁载体和纤维素酶的能力,以及固氮、溶磷和溶钾特性。通过隶属函数法进行综合分析,结果表明长枝木霉LT9为综合最佳生防菌株。通过对接种长枝木霉LT9和/或葡萄根腐病病原菌FAC-17的葡萄盆栽苗进行处理,发现LT9处理组及与LT9与FAC-17共同处理组均能显著提高葡萄多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。此外,LT9对葡萄根腐病的盆栽防治效果达到80.65%,表现出显著的生物防治潜力。 (3)通过宏基因组学分析长枝木霉LT9及锐顶镰刀菌FAC-17对葡萄根际土壤微生物群落的影响。结果表明,长枝木霉LT9单独处理可以显著改变葡萄根际微生物群落结构,提高根际土壤中候选奥米菌门(Candidatus Omnitrophota)、螺旋体门(Spirochaetota)、候选苏美尔菌门(Candidatus Sumerlaeota)、慢球体门(Methylomirabilota)、子囊菌门(Ascomycota)及鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)的相对丰度。此外,LT9处理还显著增强了根际土壤微生物的细胞周期调控、细胞分裂、染色体分配功能,并提高了次级代谢产物合成、群体感应及氨基酸合成代谢通路的丰度。在长枝木霉LT9和锐顶镰刀菌FAC-17共接种处理组中,根际土壤微生物丰富度增大,且优势菌群突出,其中绿菌门(Chloroflexota)、假单胞菌属(Pseudomonas)及罗丹杆菌属(Rhodanobacter)的丰度提高。功能分析显示,共接种处理组的微生物群落氨基酸转运与代谢、无机离子转运与代谢及脂质转运与代谢功能增强。同时,微生物代谢、ABC转运蛋白、碳代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、缬氨酸以及亮氨酸和异亮氨酸降解的代谢通路的丰度也得到提升。 (4)对接种长枝木霉LT9和/或锐顶镰刀菌FAC的葡萄植株在6 h、3 d和6 d三个时间点进行RNA-seq分析,共鉴定到141,984个差异表达基因(DEGs)。GO(Gene Ontology)功能富集分析表明,DEGs主要富集于木葡聚糖代谢过程、细胞质翻译、卵菌响应、氧化还原酶复合体、蛋白质折叠伴侣功能、热休克蛋白结合等生物学过程或分子功能类别。通过KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析发现,DEGs主要参与植物微生物相互作用、激素信号转导和苯丙烷生物合成等代谢通路,这表明植物先天免疫、植物激素转导和苯丙烷代谢在葡萄植株中构成了一个复杂的防御网络。进一步分析显示,长枝木霉LT9能够诱导葡萄植株启动转录重编程过程,乙烯(ET)、茉莉酸(JA)、细胞分裂素(CK)、生长素(IAA)、油菜素内酯(BR)和脱落酸(ABA)信号途径信号途径共同介导葡萄的(PAMP-triggered immunity)和ETI(Effector-triggered immunity)反应,进而增强苯丙烷代谢途径的活性。

摘要译文

关键词：

长枝木霉; 葡萄; 分离鉴定; 生防机理; 宏基因组; 转录组

学位年度：

2025

学位类型：

硕士

学科专业：

农业昆虫与害虫防治

导师：

于泽洋

中图分类号：

S436.631.16;S476[生物防治]

学科分类号：

090402[昆虫学];090904[草地保护学]

D O I：

10.27257/d.cnki.gnxhc.2025.001055