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一株新型沙阿霉素链霉菌的筛选及其对草鱼抗病作用的影响认领

作者：

于晓静

学位授予单位：

湖南师范大学

摘要：

我国的水产养殖业发展十分迅速,获得了可观的经济效益,但随之而来引发的问题也愈发难以控制,在防治鱼类病害的过程中,由于抗生素药物的滥用,导致鱼类病原菌耐药性增强,污染了水产品和水体生态环境。将益生菌作为微生态制剂代替抗生素应用于水产养殖业已成为一种新型且有效防治鱼类细菌性疾病的技术。本研究从河北省秦皇岛市土壤样品中筛选到一株对嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）等9种鱼类主要病原菌具有广谱抑菌活性的放线菌,通过16S r RNA分子生物学鉴定以及生理生化实验,鉴定该菌株为沙阿霉素链霉菌（Streptomyces zaomyceticus）,并将其定名为沙阿霉素链霉菌新菌株S1-6。经抑菌谱试验测定,发现菌株S1-6对嗜水气单胞菌等9种鱼类主要病原菌均表现出一定的抑制作用,其中对异常嗜糖气单胞菌（Aeromonas abnormalis）的抑菌效果最佳。经抗生素敏感实验,发现菌株S1-6对氨苄西林（Ampicillin）等抗生素不敏感,而对硫酸安普霉素（Apramycin）等抗生素敏感。经最低抑菌浓度和抑菌效价测定确定了菌株S1-6对鱼类病原菌嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度为160μg/m L,其发酵液效价相当于庆大霉素（Gentamicin）的浓度为380.19μg/m L,相当于卡那霉素（Kanamycin）的浓度为346.74μg/m L。确定了菌株S1-6在生长发酵第72 h时其发酵液的抑菌效果最好,并具有中等热稳定性和强耐酸性等性质,对于蛋白酶K以及胰蛋白酶敏感性极弱,认为该菌株的抑菌活性产物为一种小分子物质。通过对草鱼肝脏细胞L8824的毒性实验和拌菌饲喂试验证明该菌株对草鱼（Ctenopharyngodon idellus）安全无毒性。对草鱼进行30d的拌菌饲喂实验,发现试验组中草鱼的体重增长率明显高于对照组,10～9cfu/g饲喂组草鱼的体重增长率为17.19%,10～7cfu/g饲喂组草鱼的体重增长率为14.45%,显著高于对照组的体重增长率（7.40%）。通过生化测定,供试草鱼血清中溶菌酶（Lysozyme,LSZ）等酶的活力表达增强。对供试草鱼组织器官中抗氧化因子及免疫因子的表达情况进行测定,发现在肾脏与脾脏中试验组IL-8、LSZ和C3的表达相较于对照组显著上调,而LSZ和C3在肠道中则显著下调。通过病原菌嗜水气单胞菌攻毒实验发现试验组草鱼的存活率分别为80%和60%,而对照组在第5 d全部死亡,说明菌株S1-6可以显著提高草鱼对嗜水气单胞菌的抵抗力。通过小动物成像系统（IVIS）的测定,发现导入绿色荧光质粒的菌株S1-6在14 d内可以在草鱼的鳃部以及肠道中稳定地定殖、增殖和分布。同时利用导入红色荧光质粒的病原菌嗜水气单胞菌对草鱼进行攻毒,在小动物成像系统中观察7 d,发现试验组草鱼中的红色荧光信号明显弱于对照组,并且在攻毒之后试验组草鱼的存活率为80%,明显高于对照组,其中对照组草鱼在第6 d已全部死亡,进一步证明菌株S1-6可以有效提高草鱼对嗜水气单胞菌的抵抗能力。采用生物分子快速纯化系统及超高效液相色谱技术对菌株S1-6的抗菌活性产物进行分离纯化,获得一个对嗜水气单胞菌有抑菌活性的洗脱峰B-2,收集该洗脱峰结合质谱鉴定,发现该物质的质荷比（m/z）为432.05[M+H]+。进一步进行二级质谱分析、菌株S1-6的全基因组测序和生物信息学分析,推测S1-6活性物质为荷伯希二烯（Herboxidiene）的衍生物,该物质是一类具有抗菌、抗肿瘤活性的聚酮类化合物。该菌株基因组全长为8,937,949 bp,GC含量为72.40%,其中共预测到7790个完整的CDS、70个t RNA以及7套16S/23S/5S核糖体RNA。利用COG、KEGG、GO数据库对基因组功能进行注释分析,发现菌株S1-6在新陈代谢方面的功能基因占比较大。利用anti SMASH工具预测到荷伯希二烯、硫藤黄菌素（Thiolutin）、天神霉素（Istamycin）、赛苯霉素（Cypemycin）、兰卡霉素（Lankamycin）、利链菌素（Streptolydigin）等35个次级代谢产物基因簇存在于S1-6基因组中,上述活性物质均具有一定的抗菌作用,为菌株S1-6表现出的抗菌活性提供了重要依据。综上所述,沙阿霉素链霉菌新菌株S1-6有望研制成为一类能应用于鱼类细菌性病害防治的新型微生态制剂,在鱼类的健康养殖、疾病防控等方面具有潜在的应用价值。

摘要译文

关键词：

沙阿霉素链霉菌; 嗜水气单胞菌; 草鱼; 次级代谢产物; 益生菌

学位年度：

2022

学位类型：

硕士

学科专业：

微生物学

导师：

夏立秋

中图分类号：

S943[各种鱼的疾病、敌害及其防治]

学科分类号：

0906[兽医学];090806[水产医学]

D O I：

10.27137/d.cnki.ghusu.2022.000530