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附子生品与炮制品的毒性评价及减毒机制研究认领

作者：

王倩

学位授予单位：

青海大学

摘要：

附子（Aconiti lateralis radix.Praeparata.）为毛茛科乌头（Aconitum carmichaelii Debx.）的子根,因其附生于母根乌头之上,如子附母,故名附子,收录于《神农本草经》中。基于寒湿致病者适用的原则,对于阳气衰微导致体内寒邪滋生的状况,以及诸如剧烈汗出、重度喘息、突发性中风等急症,均需依赖附子以实现病情逆转。附子有大毒,主要有毒成分乌头类生物碱,能够影响心脏功能及中枢神经系统等,造成机体严重损伤,入药内服,须炮制以减毒。《本草纲目》记载蜂蜜具有解毒,润燥,以及调和百药之功效,蜂蜜减中药之毒在民间已有千年历史。民间常把附子与蜂蜜配伍服用,以减其毒,但尚缺乏标准化的蜂蜜炮制附子的工艺,且对蜂蜜炮制生附子后其毒性物质分布的改变、毒性评价及毒理机制研究较少。因此,本文以蜜附子为研究对象,利用LC-MS分析技术对其乌头类生物碱化学成分进行系统剖析,在此基础上,通过UPLC-DAD建立多指标毒效成分的含量测定方法,对其进行全面质量评价,并结合急性和长期毒性实验相关生化指标评价其毒性。基于老年阳虚证小鼠模型,利用LC-MS代谢组学研究平台揭示蜜附子的减毒机制。以下是本研究的核心内容: 1.通过超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道离子阱串联质谱（UPLC-Q-Orbitrap-MS）技术,结合自建附子属植物乌头类生物碱化学成分数据库及以及mzcloud在线资源数据库,建立了快速且全面的分析方法,用于解析附子药材的化学组分及其代谢轮廓特征。通过比对化合物的保留时间、精确分子量以及MS/MS碎片离子信息,共初步鉴定出70个生物碱类成分,包括12个双酯型二萜生物碱（DDAs）,20个单酯型二萜生物碱（MDAs）,37个醇胺型二萜生物碱（ADAs）和1个其他类生物碱。并对生物碱的二级质谱裂解规律进行解析和归纳。同时,通过使用超高效液相色谱-二极管阵列检测技术（UPLC-DAD）,建立了一种快速定量分析方法,用于测定附子中六种主要的毒性和功效成分。应用此方法,对生附子及其经过蜂蜜处理的不同煎煮时间样品进行了成分含量的比较分析,结果表明:蜂蜜能够有效降低附子毒性成分,经蜂蜜煎煮后毒性大的DDAs成分含量降低,并转化为毒性较小的MDAs。 2.采用急性毒性实验对附子生品及蜂蜜炮制品的毒性进行评价。根据毒效乌头类生物碱成分含量实验结果,选择毒性相对较小的煎煮60 min的生附子和蜜附子水煎液。结果显示生附子水煎液半数致死量(LD50)为51.78 g生药/kg,蜜附子水煎液最大给药量（MFD）为80 g生药/kg,并通过毒性症状、体重、脏器系数及病理学切片结果从表观上可知经蜜制后毒性显著降低;随后运用自然衰老的小鼠作为阳虚生物模型,进行蜂蜜减毒机制研究。生化指标血清雌二醇（E2）、睾酮（T）、环磷酸腺苷（c AMP）、环磷酸鸟苷（c GMP）水平结果显示实验小鼠造模成功,并初步证明了老年小鼠具有阳虚病症。不同分组水煎液对老年阳虚小鼠的长期毒性通过毒性症状、体重、脏器系数及组织病理学切片初步分析,并从生化指标肌酸激酶（CK）、肌钙蛋白（c Tn T）和三磷酸腺苷（ATP）进一步探讨并验证。结果显示,与MO组相比低剂量蜜附子组没有明显统计学差异,蜜附子中剂量组和生附子低剂量组表现为较轻微毒性,而蜜附子高剂量组和生附子中剂量组显示有显著毒性。 3.基于老年阳虚小鼠模型结合代谢组学技术对蜂蜜缓解附子毒性机制进行研究。基于UPLC-Q-Orbitrap-MS技术的代谢组学平台,对生附子水煎液处理前后的阳虚小鼠的内源性极性代谢物进行轮廓分析,利用OPLS-DA模型筛选与毒性相关的潜在生物标志物,对差异性代谢物进行KEGG通路富集分析,并绘制相关的代谢通路。共筛选到51种可作为毒性潜在生物标志物的差异积累代谢产物,主要包括氨基酸、有机酸、脂肪酸及胆汁酸类,重点涉及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、三羧酸循环、脂肪酸代谢等代谢通路。生附子可通过干预以上代谢途径,使大部分代谢物与模型组水平产生差异,蜜附子对这些代谢物均有显著回调作用,涉及脂质过氧化、氧化应激,炎症反应相关。从代谢组学层面对蜜附子缓解阳虚证的毒性机制进行初步阐述,深入探讨蜂蜜缓解附子毒性机制,同时为蜜附子产品的开发提供理论依据。本文旨在为蜂蜜减轻附子毒性提供理论依据,为开发附子炮制品提供新思路。

摘要译文

关键词：

生附子; 蜜附子; 乌头类生物碱; 代谢组学; 液质联用; 阳虚证

学位年度：

2024

学位类型：

硕士

学科专业：

药学

导师：

陈湘宏贾强强

中图分类号：

R285.5[中药实验药理]

学科分类号：

100505[临床中药学];100805[中药分析学];100806[中药药理学];100808[临床中药学]

D O I：

10.27740/d.cnki.gqhdx.2024.000533