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中药苦参化学成分的提取分离及其抗肿瘤活性研究认领

作者：

陈圣雪

学位授予单位：

上海工程技术大学

摘要：

中药苦参（Sophora Flavescens）属于豆科（Leguminosae）槐属（Styphnolobium Schott）植物,具有清热去火、抗菌消炎的功效。苦参主要活性成分为生物碱、黄酮、多糖类、三萜类等,具有良好的抗氧化、抗菌、抗肿瘤等生物活性,尤其苦参生物碱作为其最重要的活性成分,已在临床上用于治疗慢性乙肝、癌症、滴虫性阴道炎等病症。为了进一步挖掘苦参中的新结构活性成分,本课题以抗肿瘤活性为导向,系统地对苦参中目标成分进行了提取分离,并结合计算机辅助药物筛选技术及细胞水平活性实验进行研究,得到了2个具有新颖二聚体结构骨架的新化合物,活性良好,是潜在的抗肿瘤先导化合物。具体研究内容如下: 1、苦参总生物碱提取工艺条件的优化采用乙醇热回流法提取苦参总生物碱,以酸性染料比色法对苦参总生物碱进行定量分析。对主要影响因素乙醇浓度、提取温度、提取时间以及料液比等指标通过L9（34）正交试验设计表安排实验,获得最佳提取条件为:乙醇浓度85%,料液比为1:20,回流温度为75℃,提取时间2.0h,共提取3次,其苦参总生物碱含量达6.41%。影响总生物碱取率的因素主次排序为:乙醇浓度>料液比>提取时间>温度。 2、苦参化学成分的分离与结构鉴定采用上述最佳提取工艺制备苦参总生物碱并取氯仿萃取部位,得到520g粗提物。将粗提物通过硅胶柱色谱、反相ODS-18柱色谱、Sephadex葡萄糖凝胶柱、重结晶、中压制备液相色谱等方法进行分离纯化,成功得到12个苦参单体化合物,经1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC、HR-ESI-MS等现代波谱及光谱技术确证了它们的结构。其中包括4个黄酮类化合物（2、7、8、10）以及8个生物碱类化合物（1、3、4、5、6、9、11、12）,鉴定为:Sophobikushenine（1）,Sophobiflavanone（2）,N-6-methyl-cytisine（3）,Sophoridine（4）,Oxy-sophoridine（5）,Lupanine（6）,Trifolirhizin（7）,Kuraridin（8）,Matrine（9）,Maackiain（10）,Cytisine（11）, Oxy-lupanine（12）。Sophobikushenin是一个通过八元环连接的类金雀花碱型生物碱二聚体,而Sophobiflavanone则是一个含有薰衣草基的二聚体双黄酮,其结构中的两个黄酮通过含氮杂原子的杂环连接。这两种化合物均为新化合物且其二聚体结构骨架也是首次被发现。 3、利用计算机辅助技术的抗肿瘤活性虚拟筛选将本次分离提取出的12个苦参单体化合物作为配体组,选择HER2、EGFR等15个与抗肿瘤活性密切相关的蛋白质酪氨酸激酶靶点作为受体组,以Drug Bank数据库中已获得FDA批准上市且对上述15个靶点有抑制作用的小分子药物作为阳性参照,应用Auto Dock Vina软件进行分子对接实验,以原配体、已上市药物、配体与酪氨酸激酶中的氨基酸残基的作用位点,分子结合能为评判指标共得到4个可作为酪氨酸激酶抑制剂的有潜在活性的化合物Maackiain,Trifolirhizin,Sophobikushenine,Sophobiflavanone,初步发现并揭示了潜在活性化合物的抗肿瘤活性分子作用机制。 4、细胞水平抗肿瘤活性验证基于虚拟筛选的结果,对4个抗肿瘤活性成分Maackiain,Trifolirhizin,Sophobikushenine,Sophobiflavanone进行了的抗肿瘤细胞活性测定与验证。本文选取了具有酪氨酸激酶EGFR以及HER2高表达的人表皮癌细胞A431和人乳腺癌细胞BT474两种肿瘤细胞系,采用CCK-8法对4个活性化合物进行了细胞增殖毒性实验。结果表明,新化合物Sophobiflavanone对A431细胞IC50值为37.77μM,对BT474的IC50值为38.13μM,有中度抑制作用。基于细胞增殖实验的结果,对Sophobiflavanone进行小鼠乳腺癌细胞4T1的细胞划痕与迁移实验,证明Sophobiflavanone也具有抑制肿瘤细胞迁移的作用;由此可见,该细胞实验结果也与虚拟筛选实验的结果一致。综上,本研究通过正交设计方法确定提取苦参根部生物碱的最优工艺,利用柱层析、重结晶、中压高效制备液相色谱等多种分离手段对苦参生物碱部位进行了系统的分离纯化研究,共计从苦参根部分离出12种单体化合物。其中包括一种新型二聚金雀花碱型生物碱Sophobikushenine和一种具有薰衣草基团的含氮杂原子的双黄酮Sophobiflavanone,这两种化合物均为首次发现。对上述12个化合物首先采用计算机辅助虚拟筛选的技术手段,筛选出4个对酪氨酸激酶有抑制作用的活性化合物。CCK-8测定法也进一步验证了4个活性化合物的肿瘤细胞毒性,新化合物Sophobiflavanone对肿瘤细胞有中度抑制作用并表现出很强的抗细胞迁移活性,有望成为潜在的新型抗肿瘤先导化合物。

摘要译文

关键词：

苦参; 二聚体化合物; 酪氨酸激酶抑制剂; 虚拟筛选; 抗肿瘤活性

学位年度：

2022

学位类型：

硕士

学科专业：

化学工程与技术

导师：

尹小英

中图分类号：

R284.2[有效成分的分离与提取];R285[中药药理学]

学科分类号：

100801[中药资源学];100804[中药化学];100505[临床中药学];100806[中药药理学];100808[临床中药学]

D O I：

10.27715/d.cnki.gshgj.2022.000588