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肺炎球菌间接ELISA方法的建立及其结合疫苗的免疫原性评价认领

作者：

沈思雨

学位授予单位：

安徽农业大学

摘要：

肺炎球菌感染作为呼吸系统疾病的主要致病因素之一,水牛、猪、山羊、狗和鸡等动物易感,对人类健康也造成严重威胁。动物感染常表现为肺炎、器官衰竭,致死率较高。人类感染表现主要包括侵袭性和非侵袭性两种类型,前者可引起菌血症、脑膜炎和肺炎等,后者则包括非菌血症性肺炎和中耳炎等。为应对此类疾病的威胁,全球范围内已推出多种肺炎球菌疫苗,如肺炎球菌结合疫苗和肺炎球菌多糖疫苗。这些疫苗的广泛应用大大减少了由肺炎球菌感染引起的呼吸系统疾病的发病率和死亡率。本论文旨在评估新研发的肺炎球菌疫苗的免疫效果。为此,本文建立了肺炎球菌间接酶联免疫吸附试验方法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),并结合了多重调理吞噬杀菌试验(multiplexed opsonophagocytic killing assay,MOPA)和MTT法,作为对肺炎球菌结合疫苗免疫原性进行评价的手段。此外,我们探究了不同的小鼠品系、免疫剂量、免疫佐剂及免疫途径对肺炎球菌结合疫苗免疫原性的影响。论文的研究内容与结果如下:1.间接ELISA法检测肺炎球菌免疫抗体方法的建立:分别对酶标板、抗原包被浓度、血清稀释倍数和反应时间等条件优化,并且开展特异性和重复性试验。使用Corning 9017酶标板进行ELISA试验,无封闭液封闭程序,以1μg/mL1型肺炎球菌多糖的最佳抗原包被浓度包被抗原,抗原包被条件为在37℃包被5 h后4℃过夜,小鼠阳性血清起始稀释倍数为1600倍起,血清反应时间为120 min,酶标二抗反应时间为120 min,酶标二抗起始稀释倍数为3000倍起,最终显色时间为120 min。特异性试验、线性试验及重复性试验结果也显示:该方法特异性强,本实验室的载体蛋白破伤风类毒素和其他型肺炎多糖对ELISA检测多糖1型特异性抗体没有干扰;样品浓度与样品ELISA单位间有良好的线性关系;批间、批内重复试验的变异系数均小于20%,说明该方法重复性良好。结果显示,该方法具有良好的特异性、线性关系和重复性,为后续免疫效果评估提供了可靠的技术支持。2.运用建立的肺炎球菌间接ELISA法、肺炎球菌荚膜多糖特异性抗体多重调理吞噬试验(MOPA)以及MTT法来评价肺炎球菌结合疫苗免疫原性,以此比较分析免疫后肺炎球菌1型血清型特异性免疫球蛋白(Immunoglobulin G,IgG)抗体水平、杀菌滴度及其对T细胞增殖能力的影响。结果显示,在使用NIH小鼠为实验小鼠,磷酸铝佐剂为免疫佐剂、腹腔注射途径和0.05 mL(其中肺炎球菌1型多糖含量为0.22μg)免疫剂量的条件下,该疫苗的免疫效果更为显著。肺炎球菌结合疫苗不仅能激发机体的体液免疫,抗体水平可维持到第3次免疫14 d后达到峰值,几何平均ELISA单位值可达到7121.54,抗体几何平均滴度值可达到694;也能激发细胞免疫应答,T细胞增殖率可达到74.91±0.23,从而发挥更持久的免疫效果。综上所述,所建立的间接ELISA方法为评估肺炎球菌结合疫苗的免疫效果提供了可靠的技术手段;结合MOPA法对免疫小鼠血清中肺炎球菌抗体的杀菌能力进行检测,可评估肺炎球菌结合疫苗在不同的小鼠品系、免疫剂量、免疫佐剂及免疫途径下对机体的保护效力;并运用MTT法证明了肺炎球菌结合疫苗不仅能使机体产生体液免疫,也能产生细胞免疫,从而评估新疫苗的有效性也为肺炎球菌结合疫苗的研发和临床前实验提供了重要参考。

摘要译文

关键词：

肺炎球菌; 结合疫苗; 免疫原性; 间接酶联免疫吸附试验

学位年度：

2024

学位类型：

硕士

学科专业：

兽医硕士（专业学位）

导师：

张志忠

中图分类号：

S852.4[畜禽免疫学]

学科分类号：

090601[基础兽医学];090602[预防兽医学]

D O I：

10.26919/d.cnki.gannu.2024.000309