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五味子藤茎多糖的提取纯化、结构鉴定及抗热应激活性研究认领

被引量： 1

作者：

赵惠存

学位授予单位：

吉林农业大学

摘要：

为了更好地开发利用五味子藤茎多糖成分,拟对五味子藤茎多糖进行提取分离纯化,通过细胞实验,探索五味子藤茎多糖抗氧化活性的机理,为五味子藤茎多糖对氧化应激相关疾病的治疗药物的开发提供一定的理论支撑。本论文在课题组前期的研究基础上,对五味子藤茎多糖的提取纯化、结构表征、抗热应激活性及潜在作用机制进行研究,主要研究内容及结果如下: 1、五味子藤茎多糖的提取纯化及结构鉴定本研究采用热水浸提乙醇沉淀法获得五味子藤茎粗多糖（SSP）,通过离子交换层析（DEAE-52）和凝胶层析（Sephadex G-100）纯化得到SSP-Ⅰ,对SSP-Ⅰ的化学成分、分子量、官能团、单糖组成、糖苷键构型和糖苷键连接顺序进行了表征和分析。SSP-Ⅰ中葡萄糖含量为60.59%,具有典型的多糖结构,分子量为882k Da。高效液相色谱（HPLC）分析表明,SSP-Ⅰ是一种由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰-D氨基葡萄糖和甘露糖组成的葡萄糖半乳糖聚糖。核磁共振（NMR）分析表明,SSP-I的主链为{α→1,3-Glc-（1→}→3）-α→1,3-Glc-（1→{→3）-α-1,3-Gal-(1→},其中α→t-Glc-（1→6）等残基位于侧链,并通过Glc与主链连接。电镜扫描（SEM）分析表明,SSP-Ⅰ为无定型结构。 2、五味子藤茎多糖对H2O2致TM3细胞损伤的保护作用本部分测定了SSP-Ⅰ对ABTS自由基、DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基清除活性以及铁离子总还原能力,结果显示SSP-Ⅰ在1-10 mg/m L的浓度范围内均具有一定的抗氧化活性,IC50值分别为4.726±0.675 mg/m L,5.582±0.747 mg/m L,4.110±0.614 mg/m L和3.422±0.534 mg/m L。建立H2O2诱导小鼠睾丸间质TM3细胞损伤模型,探究SSP-Ⅰ对H2O2诱导TM3细胞损伤的保护作用。结果表明,H2O2在200μM浓度处理TM3细胞3h后,细胞活力降低到87.55%,SSP-Ⅰ在1～256μg/m L的浓度范围对TM3细胞无明显细胞毒性。与H2O2组相比,SSP-Ⅰ组均可显著减轻H2O2诱导TM3细胞损伤,并且抑制睾酮（TTE）含量降低,热休克蛋白70（HSP70）水平升高。同时,SSP-Ⅰ还能抑制丙二醛（MDA）的水平升高、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽转移酶（GSH）的水平降低。通过活性氧（ROS）染色和线粒体膜电位（JC-1）染色分析可知,SSP-Ⅰ可明显抑制ROS自由基产生和线粒体低电势数量增加,证明了SSP-Ⅰ的保护作用。通过蛋白质免疫印迹法分析可知,SSP-Ⅰ具有抑制H2O2诱导细胞凋亡的作用。 3、五味子藤茎多糖对阴囊热应激致小鼠睾丸损伤的保护作用建立阴囊热应激（Heat stres,HS）小鼠生精障碍损伤模型,探究SSP-Ⅰ的改善作用。在适应性饲养7天后,分为五组:对照组,HS组,Ⅰ组（HS+SSP-Ⅰ组）,Ⅱ组（HS+SSP-Ⅰ组）,Ⅲ组（HS+SSP-Ⅰ组）,每组8只。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组小鼠分别口服50 mg/kg、100 mg/kg和200 mg/kg SSP-Ⅰ（0.9%无菌生理盐水溶解）连续14天。第15天,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组小鼠身体的下三分之一,包括阴囊、尾巴和后腿,被浸泡在43℃水浴中18 min后放置在温暖的垫子上,以保持体温至体温恢复。再继续灌胃14天。与HS组相比,SSP-Ⅰ给药可明显抑制HS小鼠血清中TTE含量降低,HSP70水平升高,MDA水平升高及SOD的水平降低。H&E染色也表明了SSP-Ⅰ的保护作用。此外,通过免疫荧光染色、免疫组织化学染色和蛋白免疫印迹法分析可知,SSP-Ⅰ具有抑制细胞凋亡的作用。综上所述,本论文通过对五味子藤茎多糖SSP-Ⅰ的提取纯化和结构鉴定为后期的药理学实验提供了必要的物质保证。同时,对SSP-Ⅰ改善TM3细胞氧化应激损伤进行探究,较为深入的阐明了SSP-Ⅰ对阴囊热应激所致的小鼠睾丸损伤的保护作用及可能的分子机制,为开发五味子藤茎多糖提供了新的研究思路,也为治疗睾丸热应激损伤理论提供参考。

摘要译文

关键词：

五味子藤茎; 多糖; 结构鉴定; 热应激

学位年度：

2024

学位类型：

硕士

学科专业：

中药学

导师：

王梓

中图分类号：

R284.2[有效成分的分离与提取]

学科分类号：

1005[中医学];100801[中药资源学];100804[中药化学]

D O I：

10.27163/d.cnki.gjlnu.2024.000187