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苦荞蛋白肾素抑制肽的制备及作用机理研究认领

被引量： 1

作者：

顾缪颖

学位授予单位：

江南大学

摘要：

高血压是危害人类健康的一种慢性疾病。哺乳动物的血压是由肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）通过两种主要蛋白酶——肾素和血管紧张素转化酶（ACE）来调节的。肾素作为该系统的初始限速酶,可调控血管紧张素原生成血管紧张素Ⅰ的速度,因此抑制肾素的活性可从源头控制血压升高。肽具有可调控血压的活性已被证实,食源性降压肽因其安全,副作用小而被人们广泛研究。苦荞是一种药食同源农作物,已有报道从苦荞蛋白水解液中鉴定出高活性ACE抑制肽,而苦荞蛋白肽对肾素的活性抑制及其作用机理未见研究。本论文以苦荞为原料,提取四种分级蛋白后水解,分析水解液结构及其与肾素抑制活性之间的关系,选取活性较高的清蛋白和谷蛋白水解液进行分离纯化、鉴定肽序列、筛选出具有肾素抑制活性的肽;体外验证化学合成肽的肾素抑制活性并研究其结构特征;探究苦荞蛋白肾素抑制肽和肾素的相互作用方式和具体结合位点及其对肾素二级结构和三级结构的影响,为苦荞蛋白作为肾素抑制肽的来源和应用提供一定的理论基础和参考依据。主要研究内容和结果如下: 首先从苦荞中提取四种分级蛋白,采用胃蛋白酶和胰蛋白酶进行水解,检测分级蛋白水解液的肾素抑制活性,通过氨基酸分析、内源荧光光谱和SDS-PAGE等解析水解液结构,分析水解液结构与肾素抑制活性的关系。苦荞清蛋白和谷蛋白水解液的肾素抑制率和肽得率较高;清蛋白和谷蛋白富含疏水性氨基酸和带电荷氨基;蛋白质内部疏水基团暴露,荧光值增加;清蛋白和谷蛋白的大分子量蛋白消失,小分子量蛋白增多。因此,清蛋白和谷蛋白是肾素抑制肽的良好来源。其次采用阴离子交换色谱、凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱（RP-HPLC）对苦荞清蛋白和谷蛋白水解液进行分离纯化后检测肾素抑制活性。清蛋白水解液经过阴离子交换色谱分离纯化后,得到五个组分（QF1、QF2、QF3、QF4和QF5）,QF4的肾素抑制活性最高,抑制率为27.02%,然后采用凝胶过滤色谱分离QF4,得到4个组分（QF4-1、QF4-2、QF4-3和QF4-4）,QF4-1的肾素抑制活性最高,抑制率为37.61%,最后通过RP-HPLC得到三个组分（QF4-1-1、QF4-1-2和QF4-1-3）,QF4-1-3的肾素抑制活性最高,抑制率为45.12%。谷蛋白水解液经阴离子交换色谱分离纯化后得到五个不同的组分（GF1、GF2、GF3、GF4和GF5）,GF5的肾素抑制活性最高,达到32.74%,GF5组分经过RP-HPLC分离后,得到4个组分（GF5-1、GF5-2、GF5-3和GF5-4）,GF5-4的抑制率最高为28.32%,但低于GF5,肽组分间可能存在协同作用。鉴定清蛋白QF4-1-3和谷蛋白GF5-4中肽序列,并通过生物信息学手段筛选出10条多肽。然后化学合成10条多肽,测定体外肾素抑制活性。在2 mmol/L的浓度下,LFFR和LGLLPYFR的肾素抑制率最高,分别为46.67%和38.88%,IC50分别为5.00 m M和10.19 m M。其余八条多肽VEVFRPF,VVPQGF,SLRTFF、GFLVQFR、SFLFR,FFLLGPR、IQPGGLLLPSY和VPQGFA在2 mmol/L时抑制率分别为6.32±1.00%,16.55±0.11%,19.35±0.89%,37.57±2.26%,26.68±3.02%,33.88±0.54%,22.46±5.54%,31.01±0.08%。LFFR和LGLLPYFR的氨基端均含有亮氨酸（L）,羧基端均含有精氨酸（R）。体外模拟消化实验表明LFFR和LGLLPYFR在胃肠消化过程中较为稳定。最后利用酶抑制动力学和分子对接研究多肽对肾素的作用方式。酶抑制动力学显示LFFR对肾素可能为混合型抑制,LGLLPYFR的Vmax随多肽浓度的增加而降低,Km几乎不变,可能是非竞争性抑制。分子对接结果表明,LFFR和LGLLPYFR与肾素活性中心的Asp32,Asp215通过氢键和疏水相互作用连接,疏水相互作用为主要作用力。圆二色谱结果表明多肽与肾素的相互作用诱导了肾素二级结构的改变,无规则卷曲增多。荧光光谱显示LFFR和LGLLPYFR对肾素为静态猝灭,多肽与肾素的相互作用以疏水相互作用为主,与分子对接的结果一致。

摘要译文

关键词：

苦荞分级蛋白; 高血压; 肾素抑制肽; 分离纯化; 抑制机理

学位年度：

2024

学位类型：

硕士

学科专业：

食品工程（专业学位）

导师：

李永富杜艳

中图分类号：

TS201.2[食品化学]

学科分类号：

0822[轻工技术与工程];083201[食品科学]

D O I：

10.27169/d.cnki.gwqgu.2024.000241