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基于比率荧光的赭曲霉毒素A免疫分析检测方法研究认领

作者：

赵娅楠

学位授予单位：

长江大学

摘要：

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A,OTA）是曲霉和青霉产生的次级代谢产物,常见于玉米、大麦、燕麦、咖啡、葡萄和葡萄酒中。OTA具有肾毒性、肝毒性、免疫毒性、细胞毒性、致癌性、致畸性和致突变性等特点,对人和动物体健康危害极大。国际癌症研究机构将其归类为IIB类致癌物质。为了保证食品安全,许多国家规定了不同食品中OTA的最大残留限量（MRL）。例如,欧盟（EU）规定谷物中OTA的MRL为5μg/kg,婴儿食品的MRL为0.5μg/kg。中国政府允许谷物中OTA的MRL为5μg/kg。因此,建立快速准确的OTA检测方法,对严格管控食品中OTA含量,保障食品安全和人类健康具有重要意义。目前,检测OTA的几种常规方法有薄层色谱法（TLC）、气相色谱-质谱法（GC-MS）、液相色谱-质谱法（LC-MS）、高效液相色谱法（HPLC）、免疫分析法。仪器分析法结果灵敏度高、重现性好,但检测成本高,且需要熟练的操作人员因而无法满足样本的大量筛选。而免疫分析法由于操作简单、响应迅速、不受仪器设备的限制备受关注,并且大量应用于日常检测中。本研究在传统酶联免疫吸附法（ELISA）的基础上,结合比率荧光传感的快速响应,构建了三种免疫分析方法用于定量检测实际样品中的OTA含量。 1.间接竞争ELISA方法（ic-ELISA）在过氧化氢（Hydrogen peroxide,H2O2）存在的条件下,辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase,HRP）标记的二抗（Ig G-HRP）催化底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB）生成氧化态TMB,溶液由无色变为蓝色。使用硫酸（Sulfuric acid,H2SO4）终止反应后,溶液由蓝色变为黄色。通过对酶标仪读取的OD450数值进行分析,实现对OTA的定量检测。检测体系优化后,得到标准曲线方程:y=34.8687x+42.8091,相关系数R2=0.9984,线性范围为0.1594-8.3792 ng/m L,最低检测限（LOD）为0.1146 ng/m L。该方法与其他真菌毒素均不发生交叉反应。在玉米、燕麦和大米样品中的回收率分别为95.04%-109.64%、93.48%-108.43%、97.98%-116.92%,均符合美国分析化学协会（AOAC）的规定。 2.基于银纳米团簇和钙黄绿素-铈离子的比率荧光免疫分析法碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）标记的二抗（Ig G-ALP）将PNPP去磷酸化使其分解为对硝基苯酚（PNP）和磷酸根。PNP通过内过滤效应（Internal filtration effect,IFE）猝灭银簇（BSA-Ag NCs）的荧光,磷酸根通过与铈离子结合恢复钙黄绿素-铈离子体系(Calcein-Ce3+)的荧光。在400 nm和450 nm激发光下,对酶标仪在640 nm和518 nm处读出的荧光强度进行分析,实现对OTA的定量检测。得到标准曲线方程:y=34.8469-0.5649x,R2=0.9981,线性范围为0.625-25ng/m L,LOD为0.04 ng/m L。该方法特异性良好,在玉米、燕麦和大米样品中的回收率分别为94.51%-105.54%、106.49%-110.44%、91.95%-100.75%,均符合AOAC的规定。 3.ALP催化铕离子配位聚合物介导的比率荧光免疫分析法 ALP在镁离子存在的情况下催化铕离子配位聚合物（Eu-CP）分解并促进镁离子配位聚合物的生成。在354 nm激发光下,对酶标仪在418 nm和618 nm处读出的荧光强度进行分析,实现对OTA的定量检测。得到标准曲线方程:y=0.3144x+0.1629,R2=0.9909,线性范围为0.4883-62.5 ng/m L,LOD为0.0273 ng/m L。该方法特异性良好,在玉米、燕麦和大米样品中的回收率分别为107.82%-119.11%、97.83%-110.14%、97.07%-105.45%,均符合AOAC的规定。本研究建立了三种样品中定量检测OTA的免疫学方法,其中ic-ELISA检测法具有操作简便,成本低以及高通量等优点。基于BSA-Ag NCs和calcein-Ce3+的比率荧光免疫分析法的灵敏度优于ic-ELISA。ALP催化Eu-CP介导的比率荧光免疫分析法的灵敏度和检测范围均优于前两种方法。

摘要译文

关键词：

赭曲霉毒素A; 免疫分析法; 比率荧光; 内过滤效应

学位年度：

2024

学位类型：

硕士

学科专业：

兽医

导师：

周玉

中图分类号：

S859.84[动物性食品中化学物残留]

学科分类号：

090604[动物药学]

D O I：

10.26981/d.cnki.gjhsc.2024.001432