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碱性磷酸酶触发荧光-比色双模式免疫检测赭曲霉毒素A的方法研究认领

作者：

郑晓龙

学位授予单位：

长江大学

摘要：

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A,OTA）由曲霉属和青霉属菌株产生的次级代谢产物,主要分布于农产品中。OTA具有剧毒性,致癌性和致畸性,且性质稳定不易被降解,已被国际癌症研究机构（IARC）归为2B类致癌物,是目前对动物和人类最具威胁的真菌毒素之一。金纳米团簇（AuNCs）具有合成简单、稳定性高、荧光性能优异等优点,是一种优良的荧光信号输出材料。由于聚集诱导和荧光共振能量转移（FRET）,AuNCs的荧光被Cr6+淬灭,通过还原Cr6+打开。因此,AuNCs在检测传感器中作为一种荧光报告物,具有操作简单、响应迅速的优势。铈基纳米颗粒(CPNs（Ⅳ）)作为氧化酶可以在没有H2O2的情况下催化底物的氧化;被还原之后生成CPNs（Ⅲ）可以发出荧光信号。因此,CPNs（Ⅳ）在检测传感器中可作为一种荧光与比色报告物。本文首先建立了OTA的间接竞争酶联免疫检测方法（ic-ELISA）,在ic-ELISA的基础上结合碱性磷酸酶（ALP）触发AuNCs和CPNs（Ⅳ）构建OTA检测的新型免疫传感平台,具体内容如下: 1.OTA间接竞争ELISA 基于辣根过氧化物酶标记IgG（HRP-IgG）催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）显色,通过测量450 nm处的吸光度值变化实现OTA定量检测,建立了OTA的ic-ELISA检测方法。Y=41.754X-0.466,R2=0.997。线性范围为2.34-64.57 ng/mL,检测限（LOD）为1.78 ng/mL。检测玉米样品的回收率在96.88%-101.19%之间,符合国际分析化学协会（AOAC）规定的回收率有效范围标准。 2.ALP触发AuNCs开启荧光免疫检测由于FRET和AuNCs的荧光能被Cr6+淬灭。ALP催化抗坏血酸-2-磷酸盐（AA2P）去磷酸化生成抗坏血酸（AA）,AA还原Cr6+为Cr3+,同时AuNCs的荧光被打开。通过测量480 nm处荧光值的变化可实现对OTA定量检测。基于上述原理建立了ALP触发AuNCs荧光开启的OTA免疫检测方法。OTA浓度的对数与开启的荧光强度呈现良好的线性关系。线性方程为Y=-1.871X+4.614,R2=0.993。线性范围是6.25-100 ng/mL,OTA的LOD为0.693 ng/mL。玉米样品中的加标回收率在95.89%-101.08%之间,符合AOAC规定的回收率有效范围标准。表明所建立的荧光免疫检测法对于样品中OTA的检测具有良好的可靠性与实用性。 3.基于CPNs（Ⅳ）的荧光-比色双模式免疫检测 ALP标记的IgG（ALP-IgG）可催化AA2P转化为AA。后者将CPNs（Ⅳ）还原为CPNs（Ⅲ）,发出显著的荧光信号。残留的CPNs（Ⅳ）催化TMB氧化,形成具有蓝色比色信号的oxTMB。基于上述原理建立了OTA的荧光-比色双模式免疫检测方法。在荧光模式下,OTA浓度的对数与荧光强度在4.69 ng/mL至37.50ng/mL之间呈现良好的线性关系。线性方程为Y=-140.302X+241.707,R2=0.997,LOD为0.404 ng/mL。对于比色模式,OTA浓度的对数与吸光度（650 nm）在14ng/mL至300 ng/mL之间呈现良好的线性关系。线性方程为Y=0.269X-0.245,R2=0.999,LOD为0.962 ng/mL。荧光模式下,OTA在玉米样品中的回收率为97.60%-103.55%,变异系数（CV）是2.12%-5.60%。比色模式下,回收率为99.12%-102.60%,CV是1.51%-8.51%,符合AOAC标准。表明双模式免疫对于检测OTA具有良好的可靠性与实用性。

摘要译文

关键词：

赭曲霉毒素A; 碱性磷酸酶; 双模式免疫检测; 荧光; 比色

学位年度：

2024

学位类型：

硕士

学科专业：

水产

导师：

周玉

中图分类号：

TS207.5[食品污染度的测定];O657.3[光化学分析法（光谱分析法）⑨]

学科分类号：

0822[轻工技术与工程];083201[食品科学];070302[分析化学];070306[化学生物学];081704[应用化学];081706[分子化工]

D O I：

10.26981/d.cnki.gjhsc.2024.000971