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GPX7通过GPX4/ACSL4信号通路抑制三阴性乳腺癌细胞铁死亡影响紫杉醇耐药的机制研究认领

作者：

王浩辰

学位授予单位：

济宁医学院

摘要：

目的:1、阐明三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）临床样本代谢组、蛋白组特征,筛选与TNBC发生相关的差异性靶点;2、明确谷胱甘肽过氧化物7（glutathione peroxidase 7,GPX7）在TNBC组织中表达情况及与预后相关性;3、探讨GPX7在乳腺癌细胞系中表达情况及是否抑制TNBC细胞生长;4、研究GPX7对TNBC紫杉醇耐药影响;5、探究GPX7对TNBC细胞铁死亡的影响及机制。方法:1、从济宁市第一人民医院乳腺癌数据库中选取TNBC女性患者癌组织与癌旁组织共11对,对其通过代谢组、蛋白组及代谢组联合蛋白组进行鉴定数量分析、表达差异分析、基因本体（gene ontology,GO）功能分析、京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路分析等生物信息学分析,筛选癌组织与癌旁组织中显著性差异表达蛋白及相关通路。2、使用仙桃学术、the cancer genome atlas（TCGA）数据库、gene expression profiling interactive analysis（GEPIA）以及TNBC组织芯片验证GPX7蛋白在TNBC组织中表达、预后相关性;3、利用western blot（WB）,quantitative real time polymerase chain reaction（q RT-PCR）检测GPX7在人类乳腺癌细胞系中表达情况,并构建GPX7慢病毒敲低细胞模型通过克隆形成实验、流式细胞仪测凋亡观察GPX7敲低对细胞增殖、凋亡的影响;4、运用CCK-8检测法观察GPX7敲低后不同浓度的紫杉醇对细胞活力的影响;5、通过WB实验、q RT-PCR检测GPX7敲低后相关铁死亡蛋白如酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（acyl-co A synthase Long chain family member 4,ACSL4）、谷胱甘肽过氧化酶4（glutathione peroxidase 4,GPX4）的表达情况,使用铁死亡激活剂erastin进行铁死亡诱导,运用免疫荧光实验和流式细胞分析等分别观测GPX7敲低与药物erastin处理后的铁死亡相关检测指标如活性氧（reactive oxygen species,ROS）、亚铁离子(Fe2+)、脂质过氧化物（lipid peroxidation,LPO）及谷胱甘肽（glutathione,GSH）水平变化。结果:1、代谢组学联合蛋白组学分析中,差异蛋白和差异代谢物参与KEGG通路的共同通路有112种,而差异代谢物与蛋白共同参与数TOP30通路分类中,氨基酸及其类似物代谢通路有9个,占比30%。谷胱甘肽代谢通路作为其中差异性氨基酸代谢通路之一,其通路中GGCT、G6PD、GPX7、IDH2、TXNDC12蛋白表达上调,GSTM2表达下调。2、仙桃学术TCGA、GEPIA数据库显示GPX7蛋白在人类乳腺癌组织中相对于癌旁组织高表达。免疫组化染色80对TNBC和癌旁组织芯片中,48例癌组织中较癌旁组织高表达,占比60%,并且K-M生存曲线显示GPX7高表达与较差生存结果相关。3、WB、q RT-PCR提示GPX7在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB231、SUM-159中高表达,慢病毒感染敲低GPX7基因后,抑制了TNBC细胞增殖的能力,并促进了细胞凋亡。4、CCK-8实验显示GPX7敲低后,TNBC细胞的存活率明显低于对照细胞,细胞死亡数量增高。5、WB、q RT-PCR实验发现GPX7敲低后相关铁死亡蛋白GPX4呈现低表达,对应的ACSL4呈现高表达。免疫荧光实验提示GPX7敲低后,细胞ROS、Fe2+水平上升,erastin更加剧了这种现象;流式细胞分析显示GPX7敲低后细胞ROS、LPO水平上升,同样在加入erastin后这种现象更加明显;使用酶标仪检测GPX7敲低后细胞内GSH水平,提示GSH水平降低,同样加入erastin后GSH水平出现进一步降低。结论:1、TNBC癌组织与癌旁组织代谢组学联合蛋白组学分析提示氨基酸代谢相关通路发生明显变化,其中谷胱甘肽代谢通路中蛋白GPX7癌较癌旁组织高表达。2、通过公共数据库进行生物信息学分析及组织芯片验证,GPX7在三阴性乳腺癌组织呈现高表达,并与预后相关。3、GPX7在三阴性乳腺癌细胞中呈现高表达,敲低后可抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。4、GPX7敲低可增加三阴性乳腺癌细胞对化疗药物紫杉醇的敏感性。5、GPX7敲低通过增加ROS、Fe2+、LPO产生、GSH耗竭以及调控铁死亡相关蛋白GPX4、ACSL4的水平,促进三阴性乳腺癌细胞发生铁死亡。

摘要译文

关键词：

GPX7; 三阴性乳腺癌; 紫杉醇; 耐药性; 铁死亡; GPX4/ACSL4信号通路

学位年度：

2024

学位类型：

硕士

学科专业：

肿瘤学（专业学位）

导师：

蒋树龙

中图分类号：

R737.9[乳腺肿瘤⑨]

学科分类号：

1002[临床医学]

D O I：

10.27856/d.cnki.gjnyx.2024.000076