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ATPR调控lncRNA CONCR/DDX11/PML-RARα信号轴诱导急性早幼粒细胞白血病细胞分化和周期阻滞的研究认领

作者：

刘申

学位授予单位：

安徽医科大学

摘要：

急性早幼粒细胞白血病（Acute promyelocytic leukemia,APL）是急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）的一种高死亡率类型,其主要特征是骨髓和其他造血组织中存在大量不受控制生长的白血病细胞,并进入外周血液,导致正常血细胞增殖明显受到抑制。绝大多数APL患者携带PML-RARα融合基因,其编码的融合蛋白可抑制早幼粒细胞的成熟,因此抑制PML-RARα的产生对于APL的治疗具有重要的意义。目前,临床上主要采用诱导分化的策略治疗APL,其中三氧化二砷（As2O3）和全反式维甲酸（ATRA）的联合应用是首选方法。然而,ATRA在临床上的副作用尚未得到有效解决,因此迫切需要开发具有更广的治疗范围、更好溶解性的新型药物。本研究团队通过对ATRA的结构进行改造合成了全新的化合物4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯（ATPR）,该化合物具有强大的诱导肿瘤细胞分化的作用,弥补了ATRA的不足。初步研究表明,ATPR能够通过抑制PML-RARα融合蛋白的产生发挥作用,但其具体机制仍需继续研究。为了深入研究ATPR在诱导APL细胞向成熟细胞分化中的作用,我们课题组前期进行了全转录组芯片分析,比较了ATPR诱导前后急性早幼粒细胞白血病NB4细胞的基因表达情况,筛选出了差异表达的长链非编码RNA（lncRNA）,发现其中一种名为lncRNA CONCR的表达水平下调。值得注意的是,CONCR在多种肿瘤中,如肝癌、食管癌、胃癌和非小细胞肺癌等中都有相关报道,但其在白血病中的作用尚不清楚。这提示我们CONCR可能成为APL治疗的新靶点。在本研究中我们研究了CONCR在ATPR诱导APL细胞分化过程中的作用,并探讨了其可能存在的分子机制。目的: 本研究主要探究了CONCR在ATPR诱导的APL细胞分化成熟和细胞周期阻滞中的作用,以及可能涉及的分子机制。方法: 1.ATPR处理APL细胞后CONCR基因的表达变化通过GEPIA软件查询CONCR在白血病中的表达水平,以及生存期分析。使用不同浓度的ATPR(10-5M、10-6M、10-7M、10-8M和10-9M)处理NB4细胞72小时,以及用ATPR(10-6M)在不同的时间点（0 h、24 h、48 h和72 h）刺激细胞,通过qRT-PCR检测CONCR的表达。采用qRT-PCR检测ATPR在最佳浓度和时间点(10-6M,72 h)下与阳性对照药物ATRA作用下的CONCR的表达变化。 2.CONCR的沉默或过表达对ATPR诱导APL细胞周期阻滞的影响我们将含有PGMLV-CMV-H＿DDX11-AS1-Zs Green1-T2A-Puro的慢病毒转染NB4细胞以构建过表达CONCR细胞模型;将携带sh-CONCR的慢病毒转染入NB4细胞,建立了CONCR沉默的NB4细胞模型。随后,我们使用ATPR(10-6M)处理细胞并培养72小时,对于每个处理组,我们通过Western blotting技术检测了增殖相关蛋白PCNA和周期标志性蛋白的表达水平;利用免疫荧光技术检测了Ki67的表达情况;同时,通过流式细胞术分析了细胞周期各个时期的分布情况。 3.CONCR的沉默或过表达对ATPR诱导APL细胞分化的影响构建稳定过表达或沉默CONCR的NB4细胞模型,使用ATPR(10-6M,72 h)处理NB4细胞,针对各个处理组,分别通过Western blotting和流式细胞术检测细胞表面分化抗原（CD11b和CD14）的表达,再通过瑞氏-吉姆萨染色的方法观察细胞核的形态变化。 4.ATPR对CONCR/DDX11/PML-RARα信号轴的影响使用不同浓度的ATPR(10-5M、10-6M、10-7M、10-8M和10-9M)处理NB4细胞72小时,以及用ATPR(10-6M)在不同的时间点（0 h、24 h、48 h和72 h）刺激细胞,通过Western blotting和qRT-PCR检测DDX11的表达变化。通过RNA荧光原位杂交免疫荧光双染实验探究CONCR与DDX11在细胞中的分布情况;RNA免疫共沉淀实验和RNA pull-down实验检测CONCR与DDX11是否存在相互作用。再采用Western blotting检测CONCR基因的沉默或过表达时对DDX11和PML-RARα的表达变化。 5.CONCR的过表达对体内肿瘤的影响用慢病毒构建稳定过表达CONCR的NB4细胞株,皮下接种至NCG小鼠中构建异种移植瘤小鼠模型,评估过表达CONCR对小鼠肿瘤生长的影响,再采用Western blotting和免疫组化技术检测了肿瘤组织中细胞表面分化蛋白和周期相关蛋白的表达水平。结果: 1.通过GEPIA网站分析,结果显示CONCR在白血病中异常高表达,且低表达的CONCR具有更高的生存期。并且ATPR以剂量和时间依赖性的方式抑制CONCR的表达,此外单独使用ATPR和ATRA处理NB4细胞,均可以有效降低CONCR的表达。 2.CONCR的过表达或者沉默影响了ATPR诱导的NB4细胞周期阻滞,CONCR的表达水平与增殖相关。 3.CONCR的过表达或者沉默影响了ATPR诱导的NB4细胞的分化,CONCR的表达与细胞的分化相关。 4.ATPR以剂量和时间依赖性的方式抑制DDX11的表达,通过RIP实验和RNApull-down实验结果证明了CONCR与DDX11之间存在结合关系。ATPR可通过CONCR调控DDX11的表达,进而影响PML-RARα融合蛋白的表达。 5.过表达CONCR可以增加NCG小鼠的皮下成瘤能力,肿瘤重量和体积都高于对照组。过表达CONCR后周期相关蛋白水平升高,而细胞表面分化抗原的表达水平下调。CONCR能够促进肿瘤增殖并抑制分化。结论: ATPR抑制CONCR和DDX11结合可引起DDX11表达减弱,从而使PML-RARα融合蛋白合成减少,进而诱导APL细胞向成熟细胞分化并抑制增殖。

摘要译文

关键词：

ATPR; 长链非编码RNA; CONCR; DDX11; PML-RARα; 急性早幼粒细胞白血病

学位年度：

2024

学位类型：

硕士

学科专业：

药学

导师：

陈飞虎

中图分类号：

R733.71[急性白血病⑨]

学科分类号：

1002[临床医学]

D O I：

10.26921/d.cnki.ganyu.2024.001177