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白细胞介素15蛋白多肽片段的合成工艺开发及优化认领

作者：

王华贵

学位授予单位：

南京农业大学

摘要：

白细胞介素15蛋白（IL-15）是一种14-15 k Da的多效性细胞因子,在先天免疫和适应性免疫中起着关键作用。它能够刺激T细胞的增殖,诱导细胞毒性淋巴细胞和记忆表型CD8+T细胞的产生,并刺激自然杀伤（NK）细胞的增殖和维持。重组IL-15以及IL-15超激动剂已被用于临床试验。IL-15在生物医学方面有广阔的前景,相关研究均为IL-15表达蛋白,而对于IL-15化学合成仍未有相关报导。本文依据多肽片段自然化学连接（NCL）的前提,将人体IL-15分成三个片段:Asn1-Ser34,Cys35-Gly84,Cys85-Ser114,两个自然化学连接位点:Ser34-Cys35,Gly84-Cys85。利用Fmoc固相肽合成（Fmoc-SPPS）的方法探索研究了相应片段的合成路径的工艺方法。以DMF作为溶剂,Wang树脂和Rink Amide MBHA树脂为固相载体,氨基酸的量为树脂的5 eq.,每个氨基酸激活3 min,偶联1 h。先后使用了HCTU、DIEA（HCTU为树脂4 eq.,DIEA为树脂8 eq.）与Oxyma、DIC（Oxyma为树脂5 eq.,DIC为树脂10 eq.）两种氨基酸激活体系的方法。以三氟乙酸（TFA）:水（H2O）:三异丙基硅烷（TIS）为95:2.5:2.5（v/v）配制裂解液。偶联困难的氨基酸,偶联两次（30 min*2）,通过使用伪脯氨酸解决Fmoc-SPPS中聚集的问题。在合成过程中针对Cys35-Gly84疏水性强的问题先后对合成路径进行了三次实验设计及相关优化: （1）Cys35被Boc-Thz-OH替换,Cys42、Cys88上的巯基通过ACM保护。Cys35-Gly84显示出很强的疏水性,无法通过制备液相分离。（2）Boc-Thz-OH替换Cys35,Cys42、Cys88上的巯基用ACM-NMe2保护。合成Cys85-Ser114产率15.8%。虽然Cys35-Gly84由于水溶性差合成Cys35-Gly84-MMP失败,但是能够合成Cys35-Gly84-NHNH2。不过在进行制备液相分离纯化时,在色谱柱中析出,难以纯化。（3）Cys35与Cys85都用Boc-Thz-OH替换,Cys35-Gly84与Cys85-Ser114的合成都使用Rink Amide MBHA树脂,先偶联6个精氨酸,再偶联Fmoc-Me Nbz,之后再进行相关片段的Fmoc-SPPS。用具有可移除性助溶标签的半胱氨酸代替Cys42、Cys88,多肽片段偶联完后,在可移除性助溶标签上通过Fmoc-SPPS偶联三个精氨酸。最后,合成Cys42附有可移除性助溶标签的Cys35-Gly84-NHNH2,Cys88附有可移除性助溶标签的Cys85-Ser114。比较合成片段的RP-HPLC吸收峰时间,第三条合成路径合成的多肽片段显示出更好的亲水性。通过制备液相纯化合成的多肽片段,得到Asn1-Ser34-MMP 21.6%的产率;Cys42附着可移除性助溶标签的Cys35-Gly84-NHNH2产率为11.4%;Cys88附着可移除性助溶标签的Cys85-Ser114产率为14.6%。本文依据多肽片段NCL方法的前提,通过Fmoc-SPPS的方法开发且优化人体IL-15蛋白多肽片段的化学合成工艺。论述了在合成过程中遇到的一些问题以及解决方法,为合成完整的人体IL-15蛋白提供了基础。

摘要译文

关键词：

Fmoc-SPPS; 白细胞介素15; 多肽; RP-HPLC; ESI-MS

学位年度：

2022

学位类型：

硕士

学科专业：

材料与化工硕士（专业学位）

导师：

孙浩

中图分类号：

TQ936.16;TQ936.1[蛋白质水解及中间产物]

学科分类号：

081703[生物化工];083602[酶（蛋白质）工程]

D O I：

10.27244/d.cnki.gnjnu.2022.000987