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垫状卷柏双黄酮抗肝细胞癌作用研究认领

作者：

李桂花

学位授予单位：

中南大学

摘要：

背景和目的: 肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）已成为我国第四大常见恶性肿瘤及第二位肿瘤致死病因,目前临床治疗手段有限,增强抗HCC疗效仍是当下工作的重点,从传统中药中找寻低毒高效的活性成分已成为治疗HCC最有效的方式之一。传统中药卷柏为《中华人民共和国药典》收载品种,具有抗肿瘤、抗炎、降血糖、免疫调节等多种药理活性,尤其是抗肿瘤活性近年来受到广泛关注,已有研究表明中药卷柏中的双黄酮类成分是其发挥抗肿瘤作用的主要活性物质。然而目前的研究仍多集中在中药卷柏总提物、不同提取部位和常见主成分穗花杉双黄酮（Amentoflavone,AMF）,缺乏对其他双黄酮类成分活性及其作用机制研究。课题组前期从中药卷柏中分离鉴定了系列双黄酮类化合物,包括较少见的C-O-C连接方式的新化合物垫状卷柏双黄酮（Pulvinatabiflavone,PUF）等。本论文拟在课题组前期化学成分研究基础上,以体外细胞毒活性为导向,筛选出抗肿瘤活性较优的双黄酮类化合物,通过体内体外模型综合评价其抗HCC作用,采用蛋白质组学结合分子对接手段挖掘其潜在靶点及可能的作用机制,以期为HCC的防治提供新的手段和方法。方法和结果: 1.采用CCK-8法,对中药卷柏中主要双黄酮类成分AMF、PUF、罗波斯塔双黄酮（Robustaflavone,ROF）、异柳杉双黄酮（Isocryptomerin,ISO）、橡胶树双黄酮（Heveaflavone,HEF）以及双黄酮活性部位（Active Biflavonoids,ABF）进行抗肿瘤活性评价与筛选,结果表明PUF、ISO及活性部位ABF对A375、NCI-H460、NCI-H446等7种肿瘤细胞均具有较好的细胞毒作用,其中以PUF作用最强且具有广谱抗瘤活性,其效果优于阳性药5-氟尿嘧啶（5-FU）。进一步采用人肝癌细胞HepG2及裸鼠皮下移植瘤模型,对中药卷柏中含量最高的主成分AMF、体外活性最强的PUF以及活性部位ABF进行体内体外药效研究,评价三者抗HCC作用及其药效关系。（1）PUF对人肝癌细胞HepG2和SMMC-7721均显示出较强的增殖抑制活性,在HepG2细胞系中IC50为4.30μM（2.43μg/mL）,分别约为ABF(IC50=14.32μg/mL)和5-FU(IC50=89.80μM)的6倍和20倍;在SMMC-7721细胞系中IC50为9.78μM（5.54μg/mL）,分别约为ABF(IC50=16.23μg/mL)和5-FU(IC50=41.3μM)的3倍和4倍。而AMF对两株肝癌细胞系的IC50均>100μM,没有较明显的抑制活性。（2）人肝癌细胞HepG2裸鼠皮下移植瘤实验结果显示:PUF能够显著抑制肿瘤生长（抑瘤率47.38%）,且对裸鼠体重无影响;活性部位ABF虽然表现出抑制趋势但无统计学差异,而高低剂量的AMF均无明显抑瘤效果。 2.基于PUF在抗HCC作用初探中的优异表现,本论文进一步通过系统的细胞表型和皮下移植瘤实验来验证其抗HCC的生物学功能,并采用蛋白质组学结合网络药理学与分子对接技术,探讨其可能的作用机制,研究结果表明: （1）PUF呈剂量依赖性地有效抑制HepG2细胞克隆形成、迁移和侵袭,其效果明显优于活性部位ABF。（2）PUF通过阻滞HepG2细胞在周期S期来诱导其进入细胞凋亡,而活性部位ABF则表现出对HepG2细胞几乎无凋亡和阻滞效应。（3）HepG2细胞裸鼠皮下移植瘤实验结果显示:高低剂量的PUF均能够显著抑制肿瘤生长（高剂量抑瘤率59.05%,低剂量抑瘤率53.49%）,且对裸鼠体重无影响;阳性药5-FU虽然表现出抑制趋势但无统计学差异,PUF抑瘤效果优于5-FU。（4）蛋白质组学分析发现,PUF给药组显著下调4个HCC相关促癌基因纤溶酶原（Plasminogen,PLG）、基质金属肽酶3（Stromelysin-1,MMP3）、髓过氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）、磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase regulatory subunit alpha,PIK3R1）的表达,同时细胞色素P450（Cytochrome P450 1B1,CYP1B1）在PUF组中被激活,其蛋白水平显著高于空白组。结合分子对接、文献调研以及前期活性实验结果分析,PUF可能通过下调PIK3R1表达来抑制HepG2肿瘤生长,降低细胞增殖活性并诱导细胞发生凋亡。同时,PUF表现出对HepG2细胞高效的抑制迁移与侵袭活性,推测其可能是通过下调MMP3表达从而发挥抗HCC转移和治疗的作用。结论: 本论文首先通过体外细胞毒活性评价实验,筛选和发现中药卷柏中双黄酮类化合物PUF具有广谱且较优异的抗肿瘤活性,进而对其展开较为深入的抗HCC作用研究:体外细胞克隆、细胞侵袭等实验均表明PUF具有较好抗HCC活性,且其效果明显优于活性部位ABF;细胞周期实验揭示,PUF通过将HepG2细胞周期阻滞在S期发挥抗肿瘤细胞增殖作用;体内裸鼠皮下移植瘤实验表明,高低剂量的PUF均能显著抑制肿瘤的生长,且其效果明显优于活性部位ABF和阳性药5-FU。蛋白质组学及分子对接分析提示,PUF可能通过下调PIK3R1、MMP3表达而发挥抗HCC转移和治疗的作用。本论文研究结果提示,C-C连接方式的AMF作为中药卷柏及其活性部位ABF中含量最高的主成分,其体内体外抗HCC作用却均不明显,而PUF这类以C-O-C方式连接的双黄酮虽含量较低但活性明显提高,很有可能是中药卷柏发挥抗HCC作用的关键药效物质之一,也是颇具潜力的活性先导化合物,其广谱抗肿瘤作用及其深入作用机制值得进一步系统研究和阐明。图33幅,表9个,参考文献62篇

摘要译文

关键词：

卷柏; 双黄酮; 垫状卷柏双黄酮; 肝细胞癌; 蛋白质组学

学位年度：

2023

学位类型：

硕士

学科专业：

药物化学

导师：

徐康平

中图分类号：

R285[中药药理学]

学科分类号：

100505[临床中药学];100801[中药资源学];100806[中药药理学];100808[临床中药学]

D O I：

10.27661/d.cnki.gzhnu.2023.006382