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利用CRISPR/Cas9技术体内示踪肠道胆固醇吸收中的NPC1L1内吞囊泡认领

被引量： 1

作者：

武晓静

学位授予单位：

天津医科大学

摘要：

目的和内容: 心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)主要由动脉粥样硬化引起,是威胁人类健康的第一大杀手。血清过多的低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)积聚在易感动脉壁的内皮下可导致动脉粥样硬化。血清中的胆固醇主要来源于自身合成和小肠吸收途径。目前认为,哺乳动物细胞胞外游离胆固醇的吸收主要是由尼曼匹克C1型样蛋白1(Niemann–Pick type C1Like 1,NPC1L1)介导的囊泡内吞途径实现的。然而对NPC1L1介导胆固醇吸收的分子机制及其调节因素的认识还很有限。为可视化示踪肠道内源性NPC1L1介导的胆固醇吸收过程,本课题利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,将多肽标签FLAG和增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)引入到内源性NPC1L1蛋白的C端,构建NPC1L1-FLAG-EGFP(NPC1L1-FG)小鼠,检测分析NPC1L1-FG蛋白在小鼠不同组织中的表达特征,以明确改造后的内源性NPC1L1蛋白的表达分布规律;分析NPC1L1-FG小鼠全身的脂代谢表型,以明确经改造后的NPC1L1-FG蛋白是否影响胆固醇吸收及其代谢稳态。在上述功能学验证的基础上,利用该小鼠模型示踪分析肠道胆固醇吸收过程中的NPC1L1内吞囊泡形成的时效和量效关系,以及胆固醇吸收抑制药物依泽替米贝对NPC1L1-胆固醇内吞囊泡形成的抑制作用。方法: 1.制备Cas9/单向导RNA(Single-guide RNA,sg RNA)质粒:利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,针对小鼠NPC1L1基因的3’末端非编码区,设计不同sg RNA,利用细胞内的荧光素酶法,检测分析其Cas 9/sg RNA核酸酶活性,筛选出高活性的sg RNA序列,经体外转录制备sg RNA和Cas9 m RNA。 2.构建打靶载体:PCR扩增小鼠NPC1L1基因靶点的两侧同源臂,长度均约为1.5 kb,与FLAG-EGFP编码的c DNA一起克隆至打靶载体。 3.经酶切和测序鉴定正确的打靶载体DNA与sg RNA、Cas9 m RNA一起显微注射入小鼠受精卵,移植至假孕小鼠体内自然发育,生成NPC1L1-FG敲入小鼠。 4.小鼠基因型鉴定:通过基因组DNA的PCR和Southern blot分析,筛选、鉴定重组正确且无随机插入的子代小鼠。 5.荧光显微镜可视化观察和Western blot检测NPC1L1-FG蛋白在敲入小鼠各组织中的表达谱。 6.基本代谢水平检测:在高胆固醇饮食(HCD)喂养条件下,检测野生型小鼠与NPC1L1-FG小鼠的体重、血糖、进食量、粪便量、血脂、肝脏以及小肠组织中的脂质水平有无差异。 7.探究NPC1L1-FG小鼠在胆固醇诱导下小肠上皮细胞中形成的内吞囊泡数量的时效和量效关系。 8.探究NPC1L1-FG小鼠在胆固醇诱导下小肠上皮细胞中形成的内吞囊泡数量能否被胆固醇吸收抑制剂依泽替米贝所抑制。结果: 1.成功构建了Npc1l1基因敲入打靶载体,并且制备了Cas9 m RNA和高活性的sg RNA,利用CRISPR/Cas9技术获得了对内源性NPC1L1蛋白C端进行FLAG和EGFP双重标记的子代NPC1L1-FG小鼠。 2.荧光显微镜下观察和Western blot实验显示NPC1L1-FG融合蛋白特异性地表达在模型小鼠的小肠组织的绒毛上皮细胞的刷状缘,并以空回肠表达较为丰富。 3.NPC1L1-FG的纯合子小鼠与野生型小鼠具有相似的基本代谢表型和全身脂质稳态。 4.NPC1L1-FG纯合子小鼠经40mg/ml的胆固醇灌胃后5～60分钟,其空肠中段上皮细胞在15分钟时形成的NPC1L1-胆固醇内吞囊泡数量最多。 5.NPC1L1-FG纯合子小鼠灌胃以0～40mg/ml的胆固醇15分钟后,其空肠中段上皮细胞内NPC1L1-胆固醇内吞囊泡的形成具有剂量依赖性,20mg/ml时囊泡数量最多,40mg/ml时大囊泡的比例最高。 6.依泽替米贝处理小鼠后,胆固醇诱导的小肠上皮细胞中内吞囊泡的数量有降低的趋势,但无统计学差异。结论: 我们成功构建了对小鼠内源性NPC1L1蛋白进行FLAG和EGFP双重标记的NPC1L1-FG敲入小鼠模型。该小鼠模型与野生型小鼠具有类似的NPC1L1表达谱和代谢表型,表明FLAG-EGFP不影响内源性NPC1L1的表达分布和对胆固醇的吸收。该模型可以示踪NPC1L1介导的肠道胆固醇吸收,以空肠中段上皮细胞为观察对象时,用含40mg/ml胆固醇的玉米油溶液灌胃15min为示踪内吞囊泡的最佳观察条件。用胆固醇吸收抑制剂依泽替米贝处理小鼠后,胆固醇诱导的小肠上皮细胞中内吞囊泡的数量有降低的趋势,但无统计学差异。这说明依泽替米贝虽然能抑制NPC1L1摄取胆固醇,但不能完全抑制囊泡内吞过程。未来也可利用EGFP或FLAG抗体免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)富集NPC1L1蛋白及其潜在的共作用蛋白以深入探究NPC1L1摄取胆固醇的分子机制。总之,我们构建的FLAG-EGFP标记内源性NPC1L1蛋白的小鼠模型是可视化研究体内NPC1L1介导的囊泡转运和胆固醇吸收机制的有利工具,为进一步解析NPC1L1介导胆固醇吸收的具体机制及调控因素提供新的手段。

摘要译文

关键词：

胆固醇吸收; 标签蛋白; 示踪; 内吞囊泡; CRISPR/Cas9; NPC1L1; 转基因小鼠

学位年度：

2021

学位类型：

硕士

学科专业：

内科学内分泌与代谢病

导师：

章卫平

中图分类号：

R54[心脏、血管（循环系）疾病⑨]

学科分类号：

100201[内科学]

D O I：

10.27366/d.cnki.gtyku.2021.001328