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酶法水解鲣鱼红肉制备DPP-Ⅳ抑制肽及作用机制研究认领

作者：

孟令婷

学位授予单位：

浙江海洋大学

摘要：

2型糖尿病（T2DM）是一种代谢性疾病,其主要特点是高血糖,并伴随着胰岛素抵抗和其他一系列的代谢问题,并可导致常见的并发症疾病,如心血管疾病、肾功能衰竭和视网膜病变等。T2DM治疗最有效的策略是维持正常的血糖水平。大量研究表明,二肽激肽酶Ⅳ（DPP-Ⅳ）是维持正常血糖水平过程中可调控的关键酶之一。通过阻止肠促胰素激素降解和抑制DPP-Ⅳ活性来帮助控制血糖,已被认为是控制T2DM的有效方法。尽管目前已有的降糖药物,作为DPP-Ⅳ活性的抑制剂（如双胍类和磺酰脲类）在一定程度上控制了血糖,但仍有相当一部分T2DM患者未达到目标血糖控制,同时这些药物可能导致腹泻、肝损伤和不同程度的耐药等负面影响。因此,寻找副作用小的天然活性物质来改善T2DM成为近年来的研究热点。鲣鱼（Katsuwonus pelamis）是一种全球可利用的海洋资源,是能够提供高蛋白、低脂肪和热量密集的一种食物。鲣鱼加工会产生许多副产品（约占总重的50-70%）。其中,红肉是其重要副产物之一（约占鱼肉的13%-16%）并富含优质蛋白。目前,已经从鲣鱼红肉中制备出抗氧化肽、降血压肽等活性肽。然而,目前尚未有利用鲣鱼红肉去制备降血糖肽的研究。该篇文章以鲣鱼红肉为原料,通过酶解的方法制备具有DPP-Ⅳ抑制活性的生物活性肽,然后对酶解液进行分离纯化,建立神经网络模型筛选高DPP-Ⅳ抑制活性的肽,然后通过细胞免疫印迹实验对其作用机制进行研究。最终的研究结果如下: （1）确定了鲣鱼红肉DPP-Ⅳ抑制肽的最佳酶解制备工艺。以单因素试验为基础,按照Box-Behnken试验设计原则,进行响应面实验,对鲣鱼红肉DPP-Ⅳ抑制肽制备过程的酶添加量、酶解温度和酶解时间进行优化。最终结论如下:确定了中性蛋白酶为最适酶解鲣鱼红肉制备DPP-Ⅳ抑制肽的蛋白酶;其最适酶解条件为:酶添加量8160.27 U/g,酶解温度55.40℃,酶解p H 7,酶解时间5.35 h,理论水解度最大值32.57%、DPP-Ⅳ抑制率的理论最大值56.01%。对理论结果进行实验验证,实际水解度为32.19±0.39%,DPP-Ⅳ抑制率为56.00±1.14%,与响应面预测值吻合度较好。（2）分离纯化鲣鱼红肉DPP-Ⅳ抑制肽。利用膜分离技术对中性蛋白酶水解物（neutrase of protein hydrolysate,NPH）进行分离,超滤得到NPH-1（<1 KDa）,NPH-2（1～3 KDa）,NPH-3（3～10 KDa）和NPH-4（>10 KDa）四个组分。在上述所得到的四个组分当中,<1 KDa的NPH-1具有最高的DPP-Ⅳ抑制活性(65.12±7.94%,在浓度0.5 mg·m L-1时),说明其他大于1 KDa的组分含有DPP-Ⅳ抑制活性的生物活性肽含量相对来说比较低。因此,接下来通过葡聚糖凝胶G-15对NPH-1进行进一步的分离纯化,分离结果显示为四个组分,分别为T1,T2,T3和T4,其中表现出最高的DPP-Ⅳ抑制活性的是组分T2(81.18±1.76%,在浓度0.5 mg·m L-1时),表明分离纯化对提高该活性肽的的活性有一定的作用。（3）鉴定、筛选和合成鲣鱼红肉DPP-Ⅳ抑制肽。利用四极杆飞行时间质谱技术鉴定分析T2组分的多肽序列,通过神经网络建立DPP-Ⅳ抑制肽的筛选模型成功筛选出五种DPP-Ⅳ抑制肽,并通过固相合成法合成所筛选出的DPP-Ⅳ抑制肽。通过对T2组分进行序列鉴定,然后通过神经网络预测模型的建立,对具有DPP-Ⅳ抑制活性的三肽和四肽进行筛选,最终的结论如下:通过神经网络预测模型筛选出5条具有高DPP-Ⅳ抑制活性的多肽,分别是:Ala-Pro-Pro（APP）,Pro-Pro-Pro（PPP）,Asp-Pro-Leu-Leu（DPLL）,Glu-Ala-Val-Pro（EAVP）和Glu-Ala-Iie-Pro（EAIP）;成功合成了具有纯度98%以上的DPP-Ⅳ抑制肽。（4）探讨APP、PPP、DPLL、EAVP和EAIP对IR-Hep G2细胞葡萄糖代谢的影响及作用机制。通过地塞米松诱导Hep G2细胞并以细胞对葡萄糖的消耗能力为指标成功建立胰岛素抵抗模型。实验结果表明,这五种多肽可能是通过激PI3K/AKT和AMPK信号通路缓解胰岛素抵抗产生的高血糖,通过这样的作用达到降血糖的目的。

摘要译文

关键词：

酶解; 鲣鱼红肉; DPP-Ⅳ抑制肽; 神经网络; 信号通路

学位年度：

2024

学位类型：

硕士

学科专业：

农业硕士（专业学位）

导师：

周宇芳

中图分类号：

TS254.1[基础科学]

学科分类号：

0822[轻工技术与工程];083204[水产品加工及贮藏工程];090808[水产品加工与质量安全]

D O I：

10.27747/d.cnki.gzjhy.2024.000212