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马齿苋酰胺A/B/E对肺/肠损伤模型的影响认领

作者：

陈雨

学位授予单位：

山东大学

摘要：

马齿苋（PortulacaoleraceaL.）是马齿苋科马齿苋属一年生肉质草本植物，在40多个国家作为药食两用植物使用。《中国药典》记载马齿苋具有清热解毒、凉血止血和止痢功效，临床常用于肠炎和痢疾的治疗;伊朗传统医药记载马齿苋可用于治疗哮喘，具有抗菌、抗炎、降血糖、降血脂、骨骼肌舒张、气管舒张、免疫调节、抗氧化和神经保护等诸多活性，有机酸、生物碱、香豆素、黄酮和多糖是马齿苋的主要化学成分，但对应上述诸多药理活性的药效物质尚未阐明，仍有待深入研究。　　马齿苋酰胺（oleraceins）是马齿苋中特征性生物碱，除马齿苋酰胺E（oleraceinE,OE）为异喹啉酰胺，其余均为吲哚啉酰胺。利用植化分离手段以及HPLC/MS2分析技术，从马齿苋中已发现50余个吲哚啉酰胺，马齿苋酰胺A（oleraceinA,OA）和马齿苋酰胺B（oleraceinB,OB）是两个代表性吲哚啉酰胺单糖苷类化合物，在马齿苋中含量较高。OA和OB是强自由基清除剂，但对其活性探索仍不充分。鉴于马齿苋治疗哮喘的传统用途、空气污染会加剧哮喘症状，本文探讨了OA和OB对空气污染物砷诱导人支气管上皮细胞损伤模型的影响。　　另有研究报道，OE具有体外NO2-清除活性，也可显著抑制脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的RAW264.7细胞内一氧化氮（NO）的生成，具有潜在的抗炎活性;OE灌肠对2,4,6-三硝基苯磺酸（Trinitro-benzene-sulfonicacid,TNBS）诱导的大鼠炎症性肠病（Inflammatoryboweldisease,IBD）有效，可降低结肠组织丙二醛和髓过氧化物酶水平;OE还具有促进体外调节性T细胞（Regulatorycell,Treg）增殖的活性，但并未对其进行深入探索。鉴于马齿苋治疗肠炎的传统应用，本文采用LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型评价OE的体外抗炎作用，采用TNBS诱导的小鼠结肠损伤模型评价OE有效性。　　一、马齿苋酰胺A/B对亚砷酸钠诱导的Beas-2B人支气管上皮细胞损伤的影响　　实验目的:评价OA和OB对亚砷酸钠（As）诱导的Beas-2B人支气管上皮细胞损伤的影响及其机制。实验方法:比色法测定DPPH·和·OH含量、总超氧化物歧化酶（T-SOD）和过氧化氢酶（CAT）活力、还原型谷胱甘肽（GSH）含量及乳酸脱氢酶（LDH）水平;MTT法检测细胞活力;通过DCFH-DA染色和流式细胞检测对反应活性氧（ROS）进行定性和定量分析;通过Hoechst33258染色评价细胞核受损程度;使用流式细胞仪对AnnexinV/PI标记的细胞进行凋亡率分析;免疫印迹法检测MAPK信号通路蛋白表达。实验结果:OA和OB具有体外DPPH·清除作用;强于阳性对照维生素C（VC）;100μMOA和OB可显著提高亚砷酸钠（20μM）损伤的Beas-2B细胞存活率;显著提高受损细胞中抗氧化物酶CAT和T-SOD活性，降低ROS水平;OA和OB（25-100μM）显著抑制MAPK信号通路中JNK和p38的磷酸化;OA和OB（100μM）可明显缓解亚砷酸钠对细胞核的损伤并显著降低细胞凋亡率，与阳性对照5mMN-乙酰半胱氨酸（NAC）作用一致。结论:本研究首次发现OA和OB对砷损伤Beas-2B人支气管上皮细胞具有保护作用，其机制与缓解氧化应激、抑制MAPK信号通路过度激活及抑制细胞凋亡有关。　　二、马齿苋酰胺E的体外抗炎作用机制及其对炎症性肠病的有效性研究　　实验目的:（1）研究OE对LPS诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞炎症模型的影响及作用机制;（2）研究OE对TNBS诱导的小鼠急性炎症性肠病（IBD）模型的有效性。实验方法:比色法测定RAW264.7细胞中炎性介质NO的水平;MTT法检测细胞活力;qRT-PCR测定细胞中白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、一氧化氮合酶（iNOS）和环氧合酶2（COX-2）的mRNA水平;通过结肠长度、DAI评分和HE染色评估小鼠肠道损伤程度;通过酶联免疫法测定小鼠结肠组织中细胞因子IL-6、IL-1β和白细胞介素10（IL-10）及RAW264.7细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的水平;免疫印迹法检测小鼠结肠组织中iNOS、COX-2、MAPK、叉头蛋白P3（FOXP3）、维甲酸受体相关孤儿受体γ（ROR-γt），以及RAW264.7细胞中iNOS、COX-2、核因子κB（NF-κB）和MAPK信号通路蛋白的表达;免疫荧光法对细胞中NF-κBp65进行定位分析;免疫组化（IHC）技术对小鼠结肠组织中FOXP3和ROR-γt进行半定量及定位分析。实验结果:（1）与LPS（1μg/mL）诱导的RAW264.7巨噬细胞模型组相比，OE剂量依赖性显著抑制NO的生成，EC50值为21.12μM;OE剂量依赖性显著降低炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β的释放，以及iNOS、COX-2、TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平;在高剂量100μM时可显著抑制iNOS和COX-2蛋白表达;OE剂量依赖性显著降低NF-κB信号通路中IκBα和p65的磷酸化水平，在100μM时明显抑制NF-κBp65的转位入核;此外，OE对MAPK信号通路中JNK、ERK和p38蛋白的磷酸化呈剂量依赖性抑制趋势。（2）与TNBS（灌肠140mg/kg,1d）诱导的小鼠急性IBD模型相比，OE（12.5,25,50,100mg/kg，灌肠4d）可逆转结肠长度缩短、减轻结肠组织结构破坏;OE（12.5,50,100mg/kg）可显著降低结肠组织中COX-2蛋白水平，并对MAPK信号通路中ERK和p38的磷酸化呈抑制趋势;OE在100mg/kg时具有降低小鼠结肠组织中FOXP3表达、促进ROR-γt表达发挥免疫调节作用的趋势，其降低IBD模型组小鼠结肠组织中FOXP3/ROR-γt比例与阳性对照5-氨基水杨酸（5-ASA,30mg/kg）作用一致。结论:本研究首次发现OE可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中NF-κB信号通路激活并从转录和翻译水平显著抑制其下游iNOS、COX-2、以及TNF-α、IL-6炎性因子表达和释放，发挥体外抗炎作用。证实了OE对TNBS诱导的小鼠急性IBD模型的有效性，初步发现OE具有体内免疫调节作用，然而，OE是否能调节Treg/Th17细胞平衡进而影响这两类T细胞亚群中特异性转录因子FOXP3/ROR-γt比例仍有待研究。　　综上所述，OA和OB可缓解氧化应激、抑制MAPK信号通路激活、抑制细胞凋亡，保护Beas-2B人支气管上皮细胞免受亚砷酸钠损伤，研究结果从气道上皮细胞保护的角度为马齿苋治疗哮喘的传统应用提供了科学依据。OE可抑制LPS诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞炎性因子表达和释放，在体外发挥抗炎作用;OE对TNBS诱导的小鼠炎症性肠病有效，其作用机制与抑制COX-2表达以及免疫调节作用有关，上述结果为深入开展马齿苋抗炎及免疫调节药效物质研究奠定了基础，为马齿苋临床治疗肠炎提供了科学依据。

摘要译文

关键词：

马齿苋酰胺; 特征性生物碱; 肺/肠损伤; 药理活性; 药效物质

学位年度：

2024

学位类型：

硕士

学科专业：

生药学

导师：

向兰

中图分类号：

R285.5[中药实验药理]

学科分类号：

100505[临床中药学];100805[中药分析学];100806[中药药理学];100808[临床中药学]