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CaMKⅡ信号通路介导生脉散改善糖尿病小鼠心肌钙稳态及电生理重构机制研究认领

作者：

魏靖恒

学位授予单位：

中国中医科学院

摘要：

糖尿病导致的心律失常(Diabetes-inducedarrhythmias,DIA)是糖尿病主要并发症之一,其独立于其它心血管疾病,是一个漫长的心脏电生理重构过程。心律失常的发生与细胞内外离子稳态以及相关离子通道的变化密切相关,离子活动紊乱将引起心肌细胞阈电位和动作电位时程改变,导致触发电活动和心律失常的风险激增。而当前主流的抗心律失常治疗多为明确检测到心律失常事件后使用针对离子通道调节的药物。仅调节心肌离子电活动已被证实无法有效逆转该类型心律失常,从而需要额外的治疗方案来纠正离子通道重塑过程,预防心律失常发生。中医“治未病”中“既病防变”的治疗原则即要求在疾病的发生早期寻找发病的根本原因并进行有效干预。中医认为糖尿病病属消渴,本虚标实,气阴两虚为其基本病机;而心律失常病属心悸,临床常见患者证属气阴两虚。生脉散作为主治气阴两虚证的经典名方,成分明确,临床应用广泛,而其防治DIA的保护机制尚未明确。因此深入研究生脉散改善糖尿病心肌钙稳态及电生理重构机制,对于降低糖尿病诱导的恶性心律失常风险具有重要意义。研究一:钙调失衡介导Ⅱ型糖尿病小鼠室性心律失常易感性以db/db小鼠为Ⅱ型糖尿病模型组,同窝db/m小鼠为对照组。设置8w、12w和16w三个时间点分别进行血糖及糖耐量、体重、心电检测,心率变异性(HRV)时域和频域分析,并以1mg/kg异丙肾上腺素(ISO)腹腔注射模拟应激反应。分析心电结果以确定心律失常风险最高的时间点并建立模型,完成后续实验检测。通过Langendorff离体心脏灌流技术获得小鼠左室心肌细胞,以全细胞膜片钳技术检测心肌细胞动作电位、L-type钙通道(LTCC)电流和钠钙交换体(NCX)电流。荧光钙成像实验中,通过Fluo-4荧光染色心肌细胞并记录基础条件(basal)和10nMISO灌流后心肌细胞自发性钙释放(SCR)次数;分析电刺激细胞收缩时的荧光强度变化曲线,记录basal和20 mM咖啡因(caffeine)灌注下心肌钙瞬变幅值和钙消除时间常数,以caffeine灌注下的钙瞬变幅值和钙消除时间常数分别表征肌浆网钙容量(SRload)和NCX钙转运能力,并计算basal和caffeine条件下钙消除时间常数的差值以表征肌浆网钙泵(SERCA)钙转运能力;通过荧光钙泄漏实验检测高糖下心肌细胞肌浆网雷诺丁受体(RyR)钙泄漏程度。研究二:CaMKⅡ信号通路介导生脉散改善糖尿病小鼠心肌钙稳态及电生理重构(1)明确生脉散对糖尿病小鼠心室肌钙稳态及钙相关离子通道的影响。建立模型后,以8周龄小鼠进行造模给药,以db/m小鼠为正常对照组(Control);将db/db小鼠随机分为三组,模型组(Model),生脉散组(SMS,1g/kg/天灌胃给药),KN-93组(CaMKⅡ抑制剂,1mg/kg/天腹腔注射给药)。连续给药8周后,进行心电监测、心脏超声以评估生脉散对糖尿病小鼠心电活动及心脏收缩功能的影响;并取心脏进行H&E染色和Masson染色,以评估生脉散对小鼠心肌病理重构的保护作用。通过Langendorff离体心脏灌流技术获得各组16周龄小鼠左室心肌细胞,以全细胞膜片钳技术检测心肌细胞动作电位、L-type钙通道(LTCC)电流和钠钙交换体(NCX)电流。荧光钙成像实验中,通过Fluo-4荧光染色心肌细胞并分析电刺激细胞收缩时的荧光强度变化曲线,记录basal和20 mM咖啡因(caffeine)灌注下心肌钙瞬变幅值和钙消除时间常数,以caffeine灌注下的钙瞬变幅值和钙消除时间常数分别表征肌浆网钙容量(SR load)和NCX钙转运能力,并计算basal和caffeine条件下钙消除时间常数的差值以表征肌浆网钙泵(SERCA)钙转运能力;通过荧光钙泄漏实验检测高糖下心肌细胞肌浆网雷诺丁受体(RyR)钙泄漏程度。使用荧光共聚焦技术检测各组小鼠心肌细胞静息时的钙火花释放次数。(2)明确生脉散通过调控CaMKⅡ及其下游钙调蛋白的表达达到改善糖尿病小鼠心肌钙稳态及电生理重构的目的。取各组小鼠心脏左心室组织进行蛋白免疫印迹(Western Blot)实验,检测各组小鼠心肌钙离子/钙调蛋白依赖激酶(CaMⅡδ),p-Thr 286 CaMKⅡδ,Cav1.2,磷酸化他克莫司结合蛋白12.6(FKBP12.6),SERCA2a,受磷蛋白(PLB),p-T17 PLB和NCX1蛋白表达量。研究结果研究一:8周龄db/m小鼠的血糖正常且体重呈正常增长趋势,与dbm小鼠相比,db/db小鼠的血糖值和体重显著升高,糖耐量降低(P<0.0001),随着年龄的增长伴有明显的体重增加(P<0.05)。心电结果显示,在db/db小鼠中,与8周龄相比,12周龄时观察到心率(HR)减慢(P<0.05),PR、QRS和QTc持续时间无显著差异;16周龄时,观察到HR无显著差异,PR间期较短(P<0.05),QRS(P<0.001)和QTc(P<0.0001)持续时间较长。而db/m小鼠在3个时间点均未观察到明显变化。与db/m小鼠相比,db/db小鼠在8周龄和12周龄时HR减慢(P<0.001),PR、QRS和QTc时程无统计学差异;16周时,在db/db小鼠中,观察到HR无显著差异,但PR显著缩短(P<0.001),QRS(P<0.001)和QTc(P<0.0001)持续时间显著延长。通过统计心电监测全程的心律失常事件,发现各个时间点db/m小鼠和db/db小鼠发生室性期前收缩(PVC)的结果没有统计学差异。注射ISO之后,在db/db小鼠中,与8周龄和12周龄相比,16周龄小鼠的心律失常发生次数显著增高(P<0.0001);与16周龄db/m小鼠相比,db/db小鼠心律失常风险显著升高,包括室性期前收缩,多形性室性心动过速(PVT)和室性颤动(VF)发生次数增多(P<0.05),以及心律失常持续时间延长(P<0.01)。进一步分析ISO挑战后的16周龄小鼠的心电数据,与基线相比,ISO刺激后,两组小鼠的HR和PR间期均无明显变化。两组小鼠的QRS均延长(P<0.05),而QTc仅在db/db小鼠中出现延长(P<0.05)。HRV时域分析结果显示,db/db小鼠具有更低的SDNN和SDSD(P<0.05),SD1和SD2的标准差也较低(P<0.05),SD1-SD2比值较低(P<0.05)。此外,在16周龄db/db小鼠中观察到心脏交感神经(CSI)和迷走神经指数(CVI)降低(P<0.05)。HRV频域分析结果显示,LF(心脏交感神经调控水平标志)和HF(心脏副交感神经调控水平标志)降低(P<0.05),但LF-HF比值无显著变化。心肌细胞自发性钙释放实验结果显示,basal状态下,db/m与db/db两组产生的SCR没有显著差异;ISO灌流后,与db/m小鼠相比,db/db小鼠的SCR数量显著增加(P<0.0001)。电生理结果显示,与db/m相比,db/db小鼠动作电位时程APD20、APD50、APD90和APD90-50均显著延长(P<0.01),导致发生EAD和DAD;ICaL电流密度显著降低(P<0.05),ICaL激活和失活动力学数据均无统计学差异;INCX在膜电压去极化(+15mV)和超极化阶段(-75 mV)的电流密度显著降低。钙瞬变结果显示,与db/m小鼠相比,db/db小鼠钙瞬变幅值未明显改变,肌浆网钙容量明显下降(P<0.0001),钙瞬变时从肌浆网释放的比例明显增加(P<0.05),而钙消除动力学未出现明显改变。钙泄漏结果显示,与db/m小鼠相比,db/db小鼠钙泄漏总量均明显增加(P<0.0001),但db/db小鼠肌浆网钙容量出现下降。钙泄漏总量与各自的肌浆网钙库容量相比后显示,db/db小鼠钙泄漏水平较正常小鼠明显升高(P<0.0001)。以上数据表明16周龄小鼠心室电活动重构,心脏自主神经调节受损,心肌细胞钙稳态失衡,在肾上腺素能应激下的室性心律失常风险增高,遂以该时刻下的小鼠建立疾病模型进行后续实验。研究二:通过检测糖尿病各组小鼠血糖及糖耐量,发现SMS组与Model组相比并无明显差异。16周龄各组小鼠心电结果显示,在basal状态,与Control组相比,SMS和KN-93组PR、QRS和QTc时程均无统计学差异;与Model组相比,SMS组PR间期延长(P<0.05),QRS和QTc时程缩短(P<0.001),KN-93组的QRS和QTc时程缩短(P<0.0001)。注射ISO之后,与Control组相比,SMS和KN-93组PR、QRS和QTc时程均无统计学差异;与Model组相比,SMS组PR间期延长(P<0.05),QTc时程缩短(P<0.0001),KN-93组PR间期延长(P<0.05),QRS和QTc时程缩短(P<0.0001)。SMS与KN-93组相比,各参数均无统计学差异。心律失常统计结果显示,basal和ISO负载状态下各组心律失常事件发生率均无统计学差异。ISO使用前后对照结果显示,Control和SMS组的心律失常诱发率没有统计学差异,但是Model(P<0.01)和KN-93组(P<0.05)的心律失常诱发率显著增加。对ISO诱发的各类心律失常事件数量进行统计,与Control组相比,SMS组的PVC、PVT、VF事件数量均无统计学差异,KN-93组PVC数量增多(P<0.05),PVT、VF事件数量无统计学差异;与Model组相比,SMS和KN-93组PVC数量无统计学差异,PVT、VF事件数量均明显减少(P<0.05)。心脏超声结果显示,与Control组相比,Model、SMS和KN-93组左心室射血分数(EF)、左心室短轴缩短率(FS)、左心室室壁前壁、后壁厚度(LVAWTd,LVPWTd)均未出现统计学差异;SMS组左心室舒张期容积(VOLUMEd)明显增高(P<0.01);KN-93组左心室重构指数(LVRI)、VOLUMEd值相较增高(P<0.05)。与Model组相比,SMS、KN-93组EF、FS、LVAWTd、LVPWTd、LVRI、VOLUMEd均无统计学差异。SMS与KN-93组相比,各参数均无统计学差异。HE染色结果显示,各组左室与心肌横截的面积比值和左室壁厚度均无统计学差异。Masson染色结果显示,各组心肌纤维化面积无统计学差异。心肌细胞电流钳结果显示,与Model组相比,SMS和KN-93组APD20、APD50、APD90和APD90-50均显著缩短(P<0.05),SMS和KN-93组无统计学差异。ICaL电压钳结果显示,与Model组相比,SMS和KN-93组ICaL电流密度显著增加(P<0.05),SMS和KN-93组无统计学差异;各组的ICaL激活和失活动力学数据均无统计学差异。INCX电压钳结果显示,与Model组相比,INCX在膜电压去极化(+15mV)和超极化阶段(-75mV)的电流密度显著降低,SMS和KN-93组无统计学差异。钙瞬变结果显示,SMS、KN-93组肌浆网钙容量相较于Model组上调(P<0.0005),钙消除时间常数降低(P<0.05),SERCA消除加快(P<0.05),钙瞬变时从肌浆网释放的比例增加(P<0.01)。持续喷射caffeine下的SMS组消除时间常数没有变化,表明NCX的钙外排功能没有改变。SMS与KN-93组相比,各参数均无统计学差异。钙泄漏结果显示,SMS和KN93组肌浆网钙容量相较Model组明显上调(P<0.0001),SMS组和KN93组相较Model组RyR开放频率降低(P<0.0001)。共聚焦结果显示,与Control组相比,Model组肌浆网钙火花释放频率显著增高(P<0.0001),SMS组有所增加(P<0.05),KN-93组无显著性差异;SMS和KN93组相较Model组明显减少了钙火花释放次数和释放频率(P<0.01)。与Control组相比,Model组小鼠左心室心肌CaMKⅡ(P<0.001)和p-Thr 286CaMKⅡδ蛋白(P<0.0001)表达量显著增加。

摘要译文

关键词：

生脉散; CaMKⅡ; 糖尿病; 心律失常; 钙稳态; 离子通道

学位年度：

2024

学位类型：

硕士

学科专业：

中西医结合基础

导师：

孙明杰石晓路

中图分类号：

R285.5[中药实验药理]

学科分类号：

100505[临床中药学];100805[中药分析学];100806[中药药理学];100808[临床中药学]

D O I：

10.27658/d.cnki.gzzyy.2024.000300