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负载姜黄素的细胞外囊泡改善小胶质细胞衰老用于治疗AD的研究认领

作者：

储坚坚

学位授予单位：

中国人民解放军海军军医大学

摘要：

【研究背景及目的】阿尔茨海默病（AD）是最常见痴呆类型,其起病隐匿并呈进行性进展,临床主要表现为认知功能下降、精神症状和行为障碍、以及日常生活能力的逐渐下降。当前全球每年痴呆的经济负担已经达到1万亿美元,而罹患痴呆人数超过5000万,预计到2050年将达到1亿5000万[1,2]。据估计,我国目前AD患者约983万。随着中国人口结构逐渐进入老龄化,该病预计会给家庭和社会带来沉重的医疗、照料和经济负担[3]。 AD以β淀粉样蛋白沉积、Tau蛋白异常过度磷酸化为主要病理改变,最终导致神经元损伤及突触改变。目前AD致病机制尚未完全明确,几种经典的致病假说包括β淀粉样蛋白假说、Tau蛋白假说、衰老假说、线粒体级联假说、血脑屏障功能障碍假说及脑肠轴假说等[4-9]。基于当前的致病假说,临床上治疗AD的两大类药物包括胆碱酯酶抑制剂（Ch EIs）和N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂,但它们仅仅能在一定程度上改善AD的临床症状,并不能终止或者逆转疾病进程[2]。为实现疾病修正治疗,到目前为止,主流研究的热点都是聚焦在直接靶向AD的病理改变。而当前FDA批准的两个针对β淀粉样蛋白的单克隆抗体,Aducanumab和Lecanemab单抗,因其脑微出血和脑水肿等副作用,从批准到临床应用均存在争议[10,11]。因此,临床上亟需新的AD药物治疗策略。鉴于年龄与AD发病的关系,衰老在AD的致病机制中发挥重要作用[5]。虽然中枢神经系统存在神经元细胞、胶质细胞以及构成血脑屏障的周细胞、血管内皮细胞等多种细胞类型,但是最近有研究表明,小胶质细胞的衰老在促进AD的病理改变及疾病进展等方面发挥重要作用[12-14]。因此,改善小胶质细胞衰老可能是治疗AD的有效策略。基于当前抗衰老治疗药物谱的逐步拓宽,姜黄素,一种兼具抗衰老、抗炎、神经保护作用等药理活性的天然植物提取物,得到越来越多关注[15,16]。姜黄素口服的安全剂量能够达到每日8g。然而,由于其易降解、水溶性差、易代谢等特性导致生物利用度极低,由此限制了其药理学价值[16]。为增加姜黄素的生物利用度,本研究拟采用源自小鼠黑色素瘤细胞的细胞外囊泡作为负载姜黄素的生物纳米载体,并将对姜黄素改善小胶质细胞衰老、姜黄素纳米药物的表征、姜黄素纳米药物的透血脑屏障（BBB）能力及姜黄素纳米药物体内改善小胶质细胞衰老和AD相关病理进行系统探讨。旨在为抗AD药物开发提供一种新的策略和方向,同时也为抗衰老疗法治疗AD提供理论支持。【实验方法】一、过氧化氢（H2O2）诱导BV2细胞（小鼠小胶质细胞）衰老及姜黄素的抗衰老作用 1、H2O2诱导BV2细胞衰老通过CCK-8法测定H2O2对BV2细胞的毒性,确定H2O2的安全浓度范围。将BV2细胞接种在六孔板中,光学显微镜下观察BV2细胞密度。待密度为40-50%时,使用不同浓度的H2O2分别处理1至4天。处理完成后进行衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色,确定最佳H2O2浓度及处理时间。 2、姜黄素体外抗衰老作用首先,通过CCK-8法测定姜黄素对BV2细胞的毒性,确定细胞实验中姜黄素的最大安全剂量。然后,用姜黄素处理成功诱导的衰老BV2细胞模型适当的时间。通过SA-β-gal染色,Western blot（WB）检测P16INK4A蛋白水平,q PCR检测促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的m RNA表达水平这三个维度验证姜黄素的体外抗BV2细胞衰老作用。二、负载姜黄素的纳米药物（NP-CUR）的制备、表征和细胞毒性研究使用脂质体挤出器,通过挤出法制备黑色素瘤细胞囊泡（B16-EV）,并利用超声法完成NP-CUR的制备。然后使用马尔文粒度电位仪和透射电子显微镜、多功能酶标仪等对B16-EV及纳米药物的粒径、电位、形态、载药量、稳定性等进行表征分析。通过CCK-8法测试NP-CUR对BV2细胞的细胞毒性作用。通过荧光倒置显微镜进行BV2细胞对NP-CUR的摄取研究。三、B16-EV透血脑屏障能力 1、B16-EV体外透BBB模型实验将适量b.end3细胞（小鼠脑微血管内皮细胞）接种于六孔板Transwell上室中,待细胞生长融合后,通过4小时液面渗漏实验判断BBB模型造模成功。在进行B16-EV的体外透BBB模型实验前6小时将BV2细胞接种于Transwell下室,将DID标记的B16-EV加入Transwell上室,对照组加入同等剂量的游离DID。18小时后,将下室BV2细胞用Hochest33342染色,荧光倒置显微镜下观察BV2细胞对DID的摄取。 2、B16-EV体内透BBB实验 APP/PS1/TAU三转基因小鼠（3×Tg小鼠）通过腹腔注射DID标记的B16-EV及游离DID。24小时后处死小鼠并取出脑组织,置于小动物活体成像系统中拍摄观察,检测小鼠脑中荧光水平。四、NP-CUR体内抗衰老小胶质细胞并改善AD病理作用选择15-16月龄的3×Tg AD模型小鼠作为实验小鼠,小鼠每3天通过腹腔注射不同的药物（PBS缓冲液、游离姜黄素、NP-CUR）,注射15次后,处死小鼠并提取脑组织,制作成脑匀浆和脑病理切片后,通过Western Blot、免疫荧光染色实验、q PCR、尼氏染色评估NP-CUR对衰老小胶质细胞清除及AD小鼠的病理改善作用。五、NP-CUR体内生物相容性与安全性 1、各治疗组小鼠的肝肾功能等指标的差异情况在动物给药结束后,采用眼眶取血的方式收集小鼠血液,采用离心法获得血清。通过相关检验仪器和试剂,检测各组小鼠的肝肾功能等指标,以评估NP-CUR在体内是否存在肝肾毒性。 2、各治疗组小鼠重要器官病理切片情况每次给药前,测量各小鼠体重并记录。在药物治疗结束后,解剖收集各组小鼠的重要器官（心、肝、脾、肺、肾等）。然后将小鼠器官石蜡包埋行病理切片,并进行苏木精&伊红染色（HE染色）,倒置光学显微镜下观察各组的病理切片是否存在形态学改变或者炎性损伤等,进一步评估NP-CUR在体内的安全性。【实验结果】一、H2O2诱导BV2细胞衰老的最佳条件为300μM连续诱导4天。20-30μM浓度以下姜黄素对BV2细胞安全性良好。因此我们选择25μM的姜黄素进行体外抗BV2细胞衰老实验,并成功验证其能减少SA-β-gal阳性衰老小胶质细胞比例,降低P16INK4A蛋白表达及促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的m RNA表达水平。二、超声法制备NP-CUR。马尔文粒度电位仪测量其粒径及电位,负染电镜拍照显示载药前后纳米载体均为基本规则圆形。通过酶标仪测量姜黄素浓度提示NP-CUR能显著增强姜黄素的水溶性及体外稳定性。CCK-8实验表明50μM浓度及以下的NP-CUR对BV2细胞无明显毒副作用,提示NP-CUR具有缓释特性,为后续体内实验中NP-CUR的安全性提供了依据。三、细胞摄取实验结果表明,NP-CUR可以显著提升BV2细胞对姜黄素的摄取,提示B16-EV能增加细胞的药物摄取。同时,体内外穿透BBB实验表明,B16-EV组DID荧光显著升高,证实了B16-EV穿透血脑屏障的能力。四、动物实验结果表明,对比未治疗组及游离CUR组,NP-CUR组P16INK4A及IBA-1免疫荧光共定位、p-TAU、Aβ免疫荧光强度显著降低。WB结果显示NP-CUR组P16INK4A蛋白、p-TAU及APP表达减少。q PCR结果显示NP-CUR能有效降低促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的m RNA表达水平。尼氏染色结果表明NP-CUR最终挽救神经元损伤。以上结果共同说明NP-CUR能有效改善小胶质细胞衰老并缓解AD病理。五、在给药期间,各组之间小鼠体重变化方面没有观察到显著差异。治疗结束后通过对小鼠血液进行生化检测,结果显示在空白对照、游离姜黄素、NP-CUR各组之间没有观察到显著变化。同样的,对心、肝、脾、肺、肾切片并行HE染色,结果与血生化结果一致,未观察到明显的病理损伤等改变。【结论】 1、在体外细胞实验中,姜黄素可以改善H2O2诱导的小胶质细胞衰老。 2、B16-EV具有良好的透血脑屏障能力,B16-EV负载后能增加姜黄素的水溶性及细胞摄取,并具有良好的稳定性和药物缓释能力,在一定程度上降低姜黄素的细胞毒性。 3、对比游离姜黄素,NP-CUR纳米制剂具有良好的生物利用度,在体内能有效改善小胶质细胞衰老,从而改善AD相关病理,并挽救神经元损伤。 4、NP-CUR具有良好的体内生物相容性。

摘要译文

关键词：

阿尔茨海默病; 小胶质细胞; 衰老; 姜黄素; 细胞外囊泡

学位年度：

2024

学位类型：

硕士

学科专业：

神经病学（专业学位）

导师：

尹又

中图分类号：

R749.16;R749.1[脑器质性精神障碍⑨]

学科分类号：

100211[精神医学]

D O I：

10.26998/d.cnki.gjuyu.2024.000158