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龟甲介导NF-κB信号通路抑制破骨分化治疗老年性骨质疏松症的机制研究认领

作者：

张鹏

学位授予单位：

广州中医药大学

摘要：

目的: 1.通过生物信息学探讨龟甲(PT)抗老年性骨质疏松症(SOP)的潜在机制; 2.临床实验探讨PT干预下的SOP患者外周血单核细胞(HPBMs)破骨分化表型变化; 3.在动物实验中,明确PT抑制破骨分化治疗SOP的作用; 4.在细胞实验中,证实PT通过NF-κB通路抑制破骨分化治疗SOP的机制。方法: 1.生物信息学分析检索BATMAN数据库获取PT的成分及靶点信息,SOP靶点信息经由GeneCards平台获取,利用STRING数据库获取PT-SOP两者交集靶点的蛋白互作(PPI)信息,并使用Cytoscape软件、R软件、Enrichr平台进行PPI网络及“PT-成分-靶点-SOP”网络构建、GO生物过程及KEGG通路富集分析。 2.临床实验研究从SOP患者中抽取血液样本,从中提取HPBMs,CCK8法检测不同浓度PT在0、1、3、5、7d对HPBMs增殖的影响,筛选安全给药浓度;诱导HPBMs破骨分化。TRAP染色检测不同梯度浓度的PT对HPBMs破骨分化的影响。 3.动物实验研究所有实验小鼠随机分为对照组(CON组)、模型组(SOP组)、PT治疗组(PT组),其中CON组用充足的饲料和水饲养至3月龄时取材。剩余小鼠进行SOP造模后,SOP组和PT组分别予以PT和等体积溶剂干预8周后取材。分别检测:①Micro-CT比较三组小鼠L4椎体骨微结构参数的差异;②骨组织TRAP染色切片比较各组骨小梁表面的破骨分化的细胞数量及其活性。 4.细胞实验研究 (1)PT对小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMMs)增殖的影响从小鼠胫骨和股骨髓腔内分离BMMs,CCK8法检测不同浓度PT在2、3、4d对BMMs细胞增殖的影响情况,为后续实验确定无细胞毒性的给药浓度范围。 (2)PT对BMMs破骨分化的作用 TRAP染色和羟基磷灰石涂层骨吸收实验检测不同浓度PT对BMMs破骨分化及其骨吸收功能的影响。 (3)PT通过NF-κB信号通路影响破骨分化的机制 BMMs诱导破骨分化后,用不同浓度的PT干预,RT-qPCR、Western blot分别检测Nfatc1、C-fos、Traf6、Ctsk等破骨分化特异性基因、CTSK、RANK、NFATC1、C-FOS等破骨细胞相关标志蛋白以及p50、p-p50等NF-κB通路相关关键蛋白的相对表达情况。 (4)PT对NF-κB/p50轴的调控作用用TRAP染色检测PT、LPS对破骨细胞分化的作用;羟基磷灰石涂层骨吸收实验检测PT、LPS对破骨细胞骨吸收功能的作用;Western blot检测PT、LPS干预破骨细胞前后p50、p-p50的蛋白表达。结果: 1.生信分析获得PT 6个活性成分,342个靶点,其中与SOP靶点交集的有57个,功能富集分析结果共得到882个GO条目(P<0.05),涉及破骨分化等过程,KEGG通路富集得到有188个结果,涉及到41条信号通路(P<0.05),其中包括NF-κB、MAPK等关键通路。 2.临床实验 PT显著抑制RANKL诱导的HPBMs破骨分化(P<0.001),并呈一定的浓度依赖性。 3.动物实验研究 (1)PT的干预显著改善SOP小鼠的骨微结构损害在雌/雄性小鼠中,相较于CON对照组,SOP组的相对骨体积分数(BV/TV)均明显降低(P<0.001),与SOP组相比,PT干预组的BV/TV均明显升高(P<0.01)。Micro-CT 3D骨重建图显示,雄性和雌性SOP组均相较于对应的CON组,骨微细结构呈现更显著的损害,而PT干预组的骨微细结构较SOP组均显著改善。 (2)PT可以抑制SOP小鼠破骨细胞分化在雄/雌性小鼠中,PT干预组0c.N/BS、0c.S/BS对比SOP组均明显降低(P<0.05)。 2.细胞实验研究 (1)PT浓度≤20μ g/ml时不影响,BMMs-的细胞增殖,对其没有细胞毒性。 (2)PT呈一定浓度依赖性地抑制破骨分化和骨吸收 ①相较于CON对照组,1.25、2.5、5、10、20 μg/mlPT浓度干预后,破骨细胞数量显著减少(P<0.001),并成浓度依赖性;PT浓度在1.25、2.5 μg/ml浓度的PT干预后破骨细胞面积有减少趋势,但5、10、20 μg/ml浓度PT干预后,破骨细胞面积显著减少(P<0.01),并呈现一定的浓度依赖性;②与CON组相比,PT浓度在2.5、5、10 μ g/ml时,骨陷窝形成面积均显著减少(P<0.001)。 (3)PT通过对NF-κB信号转导通路的阻断作用来抑制破骨分化 ①PT浓度在1.25、2.5、5、10、20 μ g/ml时能够呈浓度依赖性下调Nfatcl、C-fos、Traf6、Ctsk基因的相对表达(P<0.05);②PT浓度在1.25、2.5、5、10 μ g/ml时能够呈浓度依赖性抑制CTSK、RANK、NFATC1、C-FOS的蛋白表达(P<0.05);③PT在15、30、45分钟三个时间段均能够明显抑制破骨细胞内p50的磷酸化水平(P<0.05)。 (4)PT下调NF-κB/p50轴抑制破骨分化 ①与CON组相比,LPS组破骨细胞数量和面积显著增加(P<0.001)。在PT干预后,LPS组的破骨细胞数量和面积均显著减少(P<0.001);②与CON组相比,LPS组骨陷窝形成面积显著增加(P<0.001)。PT干预后,LPS组的骨陷窝形成面积均显著减少(P<0.001);③与CON组相比,LPS组p50磷酸化水平(p-p50/p50比值)明显升高(P<0.001);PT干预后,可明显抑制LPS对p50磷酸化水平的上调趋势(P<0.01)。结论: 本研究从生信分析-临床-动物-细胞实验四个方面证实PT可通过下调NF-κB通路抑制破骨细胞分化,进而起到改善SOP的作用。

摘要译文

关键词：

老年性骨质疏松症; 龟甲; NF-κB; 破骨分化

学位年度：

2023

学位类型：

硕士

学科专业：

中医骨伤科学（专业学位）

导师：

梁德

中图分类号：

R259[现代医学内科疾病+⑨]

学科分类号：

100507[中医内科学]

D O I：

10.27044/d.cnki.ggzzu.2023.000562