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调脾安肠方调节肠道菌群结构防治伊立替康迟发性腹泻的机制研究认领

作者：

孙小梅

学位授予单位：

北京中医药大学

摘要：

第一章中医药预防和治疗化疗相关性腹泻Meta分析目的:系统回顾中医药预防和治疗化疗相关性腹泻（CID）的有效性、安全性及其可能机制,为后续研究调脾安肠方防治伊立替康迟发性腹泻的作用和机制提供理论基础。方法:计算机检索中国生物医学文献数据库（CBM）、Cochrane对照试验中央注册系统、Pubmed、中国临床试验注册中心、中国知网、维普和万方数据库,查找截至2022年2月的中医药预防和治疗CID的随机对照试验研究（RCT）。采用Cochrane风险偏倚评估工具评价文献质量,一式两份提取试验数据,并评估偏倚的风险。采用Review Manager 5.3软件进行数据分析。结果:最终纳入1 1项预防CID的RCT,13项治疗CID的RCT。Meta分析结果显示,中医药干预可以降低CID的发生率,缩短患者CID持续时间,提升治疗有效率,缩短治疗时间,提高患者生活质量,降低患者血清炎性因子水平,恢复患者肠道菌群和黏膜屏障稳态,且不会发生中药干预相关的不良反应。结论:化疗过程中同时给予中医药可有效防治CID,且具有较好的安全性。补气、温阳和滋阴药常用于预防CID,补气、温阳和祛湿药常用于治疗CID。降低患者血清炎症因子水平、恢复患者肠道菌群和黏膜屏障稳态为其可能的作用机制。第二章调脾安肠方通过调节CT26荷瘤小鼠肠道菌群结构防治伊立替康迟发性腹泻的机制研究目的:1.验证调脾安肠方对伊立替康迟发性腹泻的防治作用;2.探讨调脾安肠方对肠道炎症、肠黏膜屏障的影响作用;3.明确调节肠道菌群结构及其毒性代谢产物活性在调脾安肠方防治伊立替康迟发性腹泻中发挥重要作用;4.为临床应用调脾安肠方防治伊立替康迟发性腹泻提供科学证据。方法: 1.将32只健康BALB/c雌性小鼠随机分为4组:调脾安肠方组;模型对照组;黄连素组;空白对照组。除空白对照组以外的3组制备CT26皮下荷瘤小鼠模型。 2.建立伊立替康迟发性腹泻小鼠模型,观察各组小鼠腹泻发生率、严重程度等疗效指标。 3.观察各组小鼠结肠黏膜病理切片上的组织形态学差异;ELISA法检测结肠组织中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的浓度;Western Blot法检测结肠紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的表达水平。 4.分光光度法检测各组小鼠β-葡萄糖醛酸酶（β-G）活性;16srRNA高通量测序技术检测样本间、组间肠道菌群结构及分布差异。结果: 1.体重变化趋势:空白对照组体重呈稳定上升趋势,实验第1至5天,其余3组小鼠体重也逐渐上升。第5天注射伊立替康后,调脾安肠方组、模型对照组和黄连素组逐渐出现体重下降,第10天均达到体重最低值,第1 1天体重开始恢复增长。从第8天开始,与模型对照组相比,空白对照组、调脾安肠方组及黄连素组小鼠体重水平持续较高,且差异具有统计学意义（P<0.05）。 2.腹泻发生率及腹泻评分:第5天首次腹腔注射伊立替康后24小时（第6天）,各组开始出现腹泻,表明伊立替康主要导致迟发性腹泻。模型对照组小鼠在第8天全部发生腹泻,而在整个实验过程调脾安肠方组中的2只小鼠及黄连素组的1只小鼠均未发生腹泻,这表明调脾安肠方及黄连素能伊立替康迟发性腹泻起到一定的预防作用,但其差异性不具有统计学意义（P>0.05）。各组腹泻程度在第9天达到峰值,此后逐渐缓解,其中第8-12天,调脾安肠方组及黄连素组的腹泻评分较模型对照组明显偏低（P<0.05）,表明调脾安肠方与黄连素均能降低伊立替康所致迟发性腹泻的严重程度。 3.抑瘤率:5-8天应用伊立替康后,各组肿瘤体积一定程度上有所下降,且作用持续至第11天,第14天各组肿瘤体积均增长。组间比较肿瘤体积并无显著差异（P>0.05）,表明调脾安肠方不具备抑瘤作用。 4.肠黏膜病理:空白对照组为基本正常肠组织;模型对照组肠黏膜损伤明显,可见大量炎细胞浸润、肠黏膜变薄及结构紊乱,肠隐窝变浅;调脾安肠方组主要是少量炎细胞浸润及黏膜息肉样结构形成,未见其它病变;黄连素组主要是多量炎细胞浸润,未见其它病变。总体来说,伊立替康使小鼠结肠组织病变最重,调脾安肠方及黄连素均能减轻伊立替康导致的肠黏膜损伤,其中调脾安肠方的抗炎效果稍优于黄连素。 5.结肠组织中炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β浓度:模型对照组与空白对照组相比,结肠组织中的致炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β浓度明显升高（P<0.01）,这表明使用伊立替康可导致或加重炎症反应。调脾安肠方组、黄连素组与模型对照组比较,结肠组织中IL-1β、IL-6和TNF-α含量均显著降低,证明调脾安肠方及黄连素灌胃后小鼠肠道炎症反应得到明显缓解。 6.结肠组织紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的表达水平:小鼠结肠组织中紧密连接蛋白ZO-1、Occludin在模型对照组的表达水平较空白对照组显著降低（P<0.01）,显示出伊立替康可以通过下调紧密连接蛋白的表达,使肠上皮细胞间缺少紧密连接,肠道通透性增加,致病菌及内毒素等物质入侵而导致腹泻发生。调脾安肠方相比于模型对照组,Occludin表达增加,差异具有统计学意义（P<0.001）,ZO-1表达亦增加,但差异不具有统计学意义,说明调脾安肠方对于紧密连接蛋白的表达具有一定的上调作用。黄连素组与模型对照组比较,两种紧密连接蛋白的表达水平均变化不明显（P>0.05）。观察各组小鼠结肠组织中Occludin、ZO-1蛋白电泳条带也可发现,空白对照组及调脾安肠方组的紧密连接蛋白表达水平最高,模型对照组表达水平最低。 7.粪便β-G活性:与空白对照组相比较,模型对照组β-G活性明显升高,差异存在统计学意义（P<0.01）,说明给予伊立替康后,小鼠粪便内β-G活性浓度升高。与模型对照组相比较,调脾安肠方组（P<0.001）及黄连素组（P<0.05）β-G活性显著降低,其中调脾安肠方组β-G活性低于黄连素组（P<0.01）,综上说明应用调脾安肠方或黄连素可降低β-G活性,且调脾安肠方的抑制作用更明显。 8.16s rRNA测序结果显示,注射伊立替康会导致小鼠肠道菌群物种丰度、均匀度及多样性下降,而调脾安肠方干预后,迟发性腹泻模型小鼠的肠道菌群在物种丰度、均匀度及多样性均得到逆转,趋近于正常小鼠,且在菌群物种组成上,调脾安肠方组与空白对照组相似,黄连素组与模型对照组相似。空白对照组及调脾安肠方组OTUs数量较多,其次为黄连素组,模型对照组数量最少。从门水平分析,各组拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）丰度均较高,厚壁菌门（Firmicutes）在伊立替康腹泻模型组丰度相对最低,而变形菌门（Proteobacteria）及疣微菌门（Verrucomicrobia）在模型对照组中丰度较高。属水平分析,乳杆菌属（Lactobacillus）在各组均有较高丰度,阿克曼氏菌属（Akkermansia）、拟杆菌属（Bacteroides）在伊立替康干预后丰度降低,调脾安肠方治疗后丰度上调至接近正常水平。各组OTUs相比,调脾安肠方使小鼠厚壁菌门（Firmicutes）、双歧杆菌目（Bifidobacteriales）、拟杆菌目（Bacteroidales）和乳杆菌目（Lactobacillales）菌群数量增加。伊立替康导致丹毒丝菌目（Erysipelotrichales）、梭菌目（Clostridiales）、疣微菌目（Verrucomicrobiales）、伯克氏菌目（Burkholderiales）、红蝽菌目（Coriobacteriales）数量上调。调脾安肠方组的标志物种包括双歧杆菌目（Bifidobacteriales）、双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）及拟杆菌目（Bacteroidales）的S247科等。模型对照组的标志物种包括肠球菌科（Enterococcaceae）、肠球菌属（Enterococcus）、帕拉普氏菌科（Paraprevotellaceae）、普雷沃氏菌属（Prevotella）等。黄连素组的标志物种包括颤螺菌属（Oscillospira）、副拟杆菌属（Parabacteroides）、粪球菌属（Coprococcus）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）和紫单胞菌科（Porphyromonadaceae）等。结论:综上所述,调脾安肠方通过调节肠道菌群结构,对其毒性代谢产物、肠黏膜屏障及肠道炎症反应产生相应影响,达到防治伊立替康迟发性腹泻的效果。

摘要译文

关键词：

化疗相关性腹泻; 随机对照试验; 预防; 治疗; 中医药; 肠道菌群; 肠道屏障; 紧密连接蛋白; 调脾安肠方; 炎症因子; 伊立替康迟发性腹泻; β-葡萄糖醛酸酶

学位年度：

2023

学位类型：

硕士

学科专业：

中西医结合临床（专业学位）

导师：

程志强

中图分类号：

R259[现代医学内科疾病+⑨]

学科分类号：

100507[中医内科学]

D O I：

10.26973/d.cnki.gbjzu.2023.001006