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探究健脾化瘀方对H22荷瘤小鼠的抗肿瘤作用及其对菌群-粪便代谢的影响认领

被引量： 2

作者：

卢彦彤

学位授予单位：

广州中医药大学

摘要：

目的: 本实验通过构建H22肝癌细胞皮下移植瘤小鼠模型,探究健脾化瘀方对H22荷瘤小鼠的抗肿瘤作用,同时结合16S rRNA高通量测序技术和粪便代谢组学技术,了解其对小鼠肠道菌群及粪便代谢物的影响。方法: 1.健脾化瘀方药效学评价。通过体内实验,将H22肝癌荷瘤小鼠分为模型对照组(MOD)、健脾化瘀方水煎剂组(JPHA)、挥发油组(JPHB)及其两者混合给药组(JPHM)。同时设有生理状态下的空白对照组(CON)和空白给药组(JPH）。通过在药物提取过程中增设挥发油提取,进一步探讨优化复方的提取方式后复方作用的差异。连续给药14天,实验过程中观察小鼠的一般情况、体质量和突出体表肿瘤的大小。实验结束后计算各组小鼠的脏器指数和抑瘤率;通过HE染色观察小鼠各脏器的病理改变,TUNEL染色观察肿瘤组织的细胞凋亡情况;并进行生化指标的检测。借助GC/MS和UPLC-Q-TOF/MS技术对健脾化瘀方进行成分鉴定,并根据TCMSP数据库中OB和DL值进行活性成分的筛选。通过OMIM、GeneCards等靶点数据库检索,利用String和Cytoscape分析可以形成复方活性成分-疾病靶点互作网络网络,并通过Metascape的通路富集分析,预测健脾化瘀方治疗肝癌的作用通路。 2.利用16S rRNA高通量测序技术检测健脾化瘀方混合给药后,H22肝癌荷瘤小鼠的肠道菌群变化。通过OTU聚类分析、Alpha菌群多样性和LEfSe分析,可以了解复方给药后小鼠肠道菌群的多样性和丰度的变化,同时利用Picrust软件预测给药后小鼠体内菌群的功能。通过粪便代谢组学技术,分析健脾化瘀方混合给药后小鼠粪便代谢物的变化。采用UPLC-MS技术和统计分析方法,结合前面肠道菌群的变化,从复方给药后粪便代谢角度进一步阐释健脾化瘀方治疗原发性肝癌的作用机制。取小鼠的结肠组织进行HE染色观察结肠组织的病理变化。用Elisa试剂盒检测小鼠外周血中肿瘤坏死因子TNF-α的含量。结果: 1.H22肝癌荷瘤的病理状态下,健脾化瘀方三个给药组的小鼠活动能力明显强于模型对照组。JPH、JPHB和JPHM组给药后体重明显增加(P<0.05)。JPHM组给药后对比MOD组肿瘤生长得到明显的抑制(P<0.05)。脏器指数统计发现,健脾化瘀方三个给药组比MOD组的脾脏指数明显减少(P<0.05),而MOD组和CON组相比则显著增大(P<0.05)。生理状态下健脾化瘀方给药后小鼠活动能力明显强于空白对照组。各组的BUN、AST、ALT检测结果发现组间没有差异。肿瘤的HE染色和TUNEL染色结果可以看出,JPHB和JPHM组对诱导肿瘤组织中细胞的凋亡和破坏肿瘤组织结构的作用明显。组织切片HE染色中,MOD组小鼠的HE染色可见肝组织损伤,给药后,损伤出现不同程度的减轻;MOD组小鼠脾脏组织结构出现破坏,给药后组织结构破坏明显减少,但JPHA组与JPHB组的保护作用不明显;MOD组小鼠肾小管出现扩张,肾小球有萎缩的情况,三个中药给药组肾脏的结构正常。健脾化瘀方成分鉴定得到2264个化合物,进行筛选后有232个潜在活性成分。经过分析可以推测健脾化瘀方可能通过53个靶点治疗原发性肝癌,其中6个核心靶点分别是TP53、TNF、AKT1、ESR1、CASP3、MAPK3。通路富集分析结果表明,健脾化瘀方可以参与NF-κ B、JAK-STAT、Wnt等信号通路。 2.小鼠粪便菌群的16s rRNA测序结果提示,健脾化瘀方给药后小鼠肠道菌群结构发生变化,优势菌属丰度发生明显改变,给药后厚壁菌门丰度下降、双歧杆菌丰度显著上升。粪便非靶向代谢组学分析中表明,中药复方给药后小鼠粪便中显著增多的代谢物大多数为与中药成分相关的的物质:有萜类化合物、类黄酮化合物、生物碱类化合物和香豆素类化合物;脂质:有类聚酮类化合物、脂肪酰基和固醇脂质;有生物作用的代谢物:苯和衍生物、有机酸和酚类、吲哚、嘌呤。经过分组,具有强大抗炎作用的Resolvin d1在健脾化瘀方给药后明显增加。通过KEGG富集分析对甄别出来的代谢物进行功能注释,确定代谢物主要参与生化代谢途径和信号转导途径。结合肠道菌群的变化和结肠病理染色,可以得知健脾化瘀方可能通过增加双歧杆菌的丰度、增加Resolvin d1的分泌、减轻肠道的损伤和减少促炎因子的产生。结论: 健脾化瘀方治疗原发性肝癌的作用体现在抑制肿瘤的生长,保护脏器,改变肠道菌群的结构。这个过程增加了抗炎作用物质的产生,减少促炎因子的水平,从改善机体炎症情况治疗原发性肝癌,结合代谢组学和通路富集的结果推测其可能通过参与调控NF-κ B通路发挥作用。

摘要译文

关键词：

健脾化瘀方; 原发性肝癌; 肠道菌群; 代谢组学

学位年度：

2022

学位类型：

硕士

学科专业：

中医内科学

导师：

王昌俊

中图分类号：

R285.5[中药实验药理]

学科分类号：

100505[临床中药学];100805[中药分析学];100806[中药药理学];100808[临床中药学]

D O I：

10.27044/d.cnki.ggzzu.2022.000924