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梧州六堡茶化学成分分析及对湿热型便秘大鼠的作用机制研究认领

作者：

吴志敏

学位授予单位：

广东药科大学

摘要：

目的:六堡茶是一种后发酵黑茶,属茶科[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]品种之一。多有研究表明茶叶有清热化湿、调节肠胃的功效。但关于六堡茶对湿热型便秘的研究目前鲜有报道。以广西梧州六堡茶作为研究对象,首先采用液质联用和气质联用技术对其进行初步定性分析,再结合网络药理学预测六堡茶改善湿热型便秘的潜在作用机制。在前两章的基础上,通过构建湿热型便秘大鼠模型,从多方面评价六堡茶对湿热型便秘的药效作用机制。采用16s r RNA高通量测序技术探究六堡茶改善湿热型便秘与肠道菌群的关系,初步探讨其微生物作用机制。项目研究从化学成分分析,网络药理学预测,动物模型药效机制及肠道菌群的角度明确六堡茶改善湿热型便秘的机制,为六堡茶的产业开发提供研究基础。方法:(1)六堡茶的化学成分分析采用液质联用和气质联用技术对梧州六堡茶进行化学成分定性分析,对梧州六堡茶的化学成分进行鉴定,为六堡茶的化学基础提供依据。(2)六堡茶干预湿热型便秘的网络药理学研究采用网络药理学方法预测六堡茶改善湿热型便秘的潜在作用机制。基于文献挖掘和数据库搜索,收集六堡茶活性成分,同时结合质谱鉴定成分,预测共有成分的作用靶点;通过疾病数据库对湿热型便秘的疾病靶点收集后,将共有成分的作用靶点与疾病作用靶点相映射以获得共同作用靶点集,通过PPI、GO、KEGG等信号途径,预测六堡茶改善湿热型便秘的潜在作用机制。(3)六堡茶对湿热型便秘大鼠的药效学研究以雄性SD大鼠作为研究对象,通过高温高湿、饥饱失常、肥甘厚味及疲倦过劳的造模方法建立起湿热型便秘的中医证候模型,随机将大鼠分为正常组、模型组、六堡茶低剂量组、六堡茶高剂量组。在实验中期和后期,以各组大鼠的毛发、精神状态及粪便含水率作为模型成型的依据。造模后,采用全自动生化检测仪及ELISA法测定大鼠血液生化指标含量(血脂四项丙氨酸转氨酶、尿酸、D-乳酸)以及血清中四种肠神经递质水平(一氧化氮、血管活性肠肽、胃动素、P物质);对大鼠的结肠、胃、肾组织进行HE染色切片以观察组织形态学变化,并在病理切片的基础上,对结肠、胃、肾组织的三种炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)进行免疫组化分析;采用实时定量PCR检测结肠、胃、肾组织中的AQP3、AQP4、AQP8基因的表达情况。以此评价六堡茶改善湿热型便秘的药效学作用。(4)六堡茶对湿热型便秘大鼠肠道菌群研究基于前章节的动物实验,以正常组大鼠作为对照,运用16s r RNA高通量测序技术对V3～V4高变区域进行测序,结合生物信息学技术分析湿热型便秘大鼠模型的肠道菌群结构,初步探索其微生物作用机制。结果:(1)六堡茶的化学成分分析通过液质联用和气质联用技术鉴定出113种化合物。通过已知文献报道、对照品信息和谱库分析鉴定出槲皮苷、表没食子儿茶素等黄酮类,缬氨酸、D-脯氨酸等氨基酸类,硬脂酰胺、十六碳酰胺等酰胺类物质等。根据初步鉴定出化合物分类情况,可知六堡茶的成分组成主要为黄酮类、酰胺类、氨基酸类。(2)六堡茶干预湿热型便秘的网络药理学研究数据库搜索与质谱匹配所得的共有成分有9个,六堡茶改善湿热型便秘的潜在作用靶点有74个。富集分析可得MAPK1、MAPK3、MAPK8、TP53、IL6、TNF等22个核心靶点主要作用于PI3K-AKT、Human cytomegalovirus infection、MAPK等信号通路中。核心靶点及富集结果提示六堡茶可能通过多个成分作用于多条通路调控炎症因子和MAPK因子的表达直接或间接干预湿热型便秘。(3)六堡茶对湿热型便秘大鼠的药效学研究与正常组比较,造模过程中模型组大鼠的毛发逐渐发黄并且蓬松欠光亮,进食量明显减少并且体重明显下降(P<0.05),粪便颗粒变小,质地干燥,其含水量降低(P<0.05),精神上表现为眯眼蜷缩、抱团拱背,而且触碰到鼠体时,多见精神紧张暴躁;血清中胃泌素、D-乳酸、胃动素、P物质、血管活性肠肽和一氧化氮的分泌量明显增多(P<0.05),并且血脂水平表现为异常;炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β在模型组大鼠的结肠、胃、肾组织分泌量明显增多(P<0.05)。此外,与正常组相比,在模型组大鼠的结肠和胃组织中,AQP3和AQP4的基因表达明显增强(P<0.01),AQP8的基因表达明显降低(P<0.01);在肾组织中,模型组的三种水通道蛋白表达量明显下降(P<0.05)。六堡茶干预后,大鼠的毛发发黄状态得到改善,并且少见眯眼蜷缩现象,提高了湿热型便秘大鼠的粪便含水量,降低了胃泌素、D-乳酸、胃动素、P物质、血管活性肠肽和一氧化氮的分泌量,减少了炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β的表达,改善了结肠、胃、肾组织中的炎症浸润状态及三种水通道蛋白的基因表达。(4)六堡茶对湿热型便秘大鼠肠道菌群研究从各组的OTU数量以及α多样性来看,湿热型便秘大鼠模型肠道菌群的相对丰度和多样性最低,其肠道菌群结构得到破坏,侧面表明造模成功;在门水平上发现2个具有显著性变化的菌门,在属水平上发现15个具有显著性差异的菌属。结合属水平上菌属所归属的菌门,发现多数归属厚壁菌门和拟杆菌门。六堡茶干预后,大鼠肠道菌群较模型组相对丰富和多样化,并逐渐趋向正常组大鼠。将各药效指标与肠道菌群进行关联度分析,门水平和属水平上均具有明显的相关性。结论:本研究先通过液质和气质联用技术鉴定出113种化合物,之后借助网络药理学预测六堡茶可能是通过多个成分作用于多条通路调控炎症因子和MAPK因子的表达直接或间接干预湿热型便秘。通过构建湿热型便秘大鼠模型,六堡茶干预后,提高了大鼠的粪便含水量,猜测六堡茶可能通过降低血清中SP、VIP、MTL及NO的分泌量,减少炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β的表达,及调控结肠、胃、肾组织中三种水通道蛋白的基因表达和肠道菌群结构,以此综合改善湿热型便秘。

摘要译文

关键词：

梧州六堡茶; 化学成分; 湿热型便秘; 肠道菌群

学位年度：

2022

学位类型：

硕士

学科专业：

药学

导师：

曾宇

中图分类号：

R284[中药化学];R285.5[中药实验药理]

学科分类号：

100801[中药资源学];100804[中药化学];100505[临床中药学];100805[中药分析学];100806[中药药理学];100808[临床中药学]

D O I：

10.27690/d.cnki.ggdyk.2022.000049