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HTLV-1病毒蛋白Tax调控应激颗粒形成的动态变化及其分子机制
作
者：
吴夏俊鹏
学
位
授
予
单
位：
摘
要：
成人T细胞白血病(Adult T-cell leukemia,ATL)是一种由人类T细胞白血病病毒 1 型(Human T-cell leukemia virus type 1,HTLV-1)感染引起的 T 淋巴系统的恶性增殖疾病。HTLV-1是第一个被发现与人类恶性肿瘤相关的逆转录病毒。在ATL发生过程中,HTLV-1编码的病毒蛋白Tax、HBZ发挥重要作用。尽管HTLV-1病毒从发现至今已经有四十多年,但是该病毒与宿主细胞之间相互作用的机制至今仍未完全阐明。当病毒侵染宿主细胞时,细胞会在胞浆中形成一种包含翻译起始复合物以及相关物质的非膜可逆性聚集体,这种可逆聚集体称为应激颗粒(Stress Granules,SGs)。应激颗粒能够影响病毒翻译,促进宿主细胞天然免疫,从而发挥抗病毒的作用。近年来,越来越多的研究从应激颗粒角度来研究病毒与宿主细胞之间的关系。我们之前的研究发现HTLV-1病毒能够动态调控应激颗粒的形成,而Tax在ATL的发生中发挥关键作用。因此本课题猜测,病毒蛋白Tax是否在HTLV-1病毒对SGs的调控中发挥一定功能呢?据此,本课题研究了 HTLV-1病毒蛋白Tax对SGs的形成及其动态变化的调控作用,并进一步探究其分子机制。研究内容及结果如下: 第一部分:HTLV-1病毒Tax蛋白诱导SGs形成 为了探究病毒蛋白Tax能否调控SGs形成,本研究在HeLa细胞株中过表达Tax后,以G3BP1作为SGs标志物运用免疫荧光实验检测SGs的形成。研究结果显示,在过表达Tax 36 h后,胞浆中出现了 G3BP1标记阳性的较大、呈现点状分布的颗粒。为了进一步确认胞浆中形成的颗粒为应激颗粒,本实验使用其他SGs标志蛋白,例如G3BP2、TIA-1、eIF4G进行免疫荧光染色。实验结果显示,在过表达Tax的细胞中形成的颗粒均能被不同SGs标志蛋白所标记,以上结果证明了 Tax可以诱导宿主细胞产生SGs。随后,研究检测了 Tax的表达是否能动态调控SGs的形成。实验结果表明在Tax表达的前期,即12-48 h时,Tax能诱导SGs装配,产生SGs的细胞比例随时间呈现上升的趋势;而在Tax表达后期,即60-72 h时,SGs逐渐解聚直至最后消失,产生SGs的细胞比例减少。以上实验证明Tax能诱导SGs形成,同时对SG形成具有动态调控功能,即前期诱导SGs形成,后期促进SGs解聚。 第二部分:HTLV-1病毒Tax蛋白诱导应激颗粒形成的分子机制 由于Tax动态调控SGs形成的过程比较复杂,本研究只聚焦了 Tax在前期诱导SGs的过程,并进行了深入研究。为了探究Tax诱导SGs形成的分子机制,本研究首先检测了 Tax对于SGs形成的关键蛋白及其磷酸化的影响。文献报道,PKR的磷酸化能够诱导eIF2α的磷酸化,进而诱导SGs的形成。Western Blot实验显示,Tax表达能够显著诱导eIF2α和PKR磷酸化。并且在Tax表达的前期,PKR和eIF2α磷酸化水平上升,表达60 h以后PKR和eIF2α水平显著下降。以上实验证明了 Tax通过PKR-eIF2α级联反应诱导SGs形成及其动态变化。文献表明PKR作为dsRNA的响应因子其磷酸化还可以受上游蛋白PACT和TRBP的调控,其中PACT促进PKR磷酸化,TRBP抑制PKR磷酸化。为了进一步探究Tax对PKR调控的机制,本研究通过免疫共沉淀实验检测了 Tax与PACT和TRBP的结合。结果显示,Tax与PACT和TRBP两个蛋白均有互作,并且Tax能够通过促进TRBP和PACT的异二聚化,从而促进PKR的磷酸化。此外,免疫共沉淀实验还发现Tax可以与PKR结合,而且Tax能促进PKR的自二聚化,进而实现PKR的磷酸化。以上实验证明,,Tax可以通过对于PACT、TRBP以及PKR三者的调控,进而通过PKR-eIF2α级联反应,诱导SGs产生。 第三部分:利用HTLV-1病毒Tax蛋白突变体探究其调控SGs形成的机制 为了进一步探究Tax对于SGs调控的分子机制,本实验利用Tax缺失型突变体探究其对SGs的调控作用。首先,本研究构建Tax截短型突变体TD1、TD55、TD99、TD150、TD254、TD319。随后利用上述突变体通过免疫荧光实验寻找Tax对SGs调控的关键区段。免疫荧光实验结果显示,Tax突变体TD99、TD150几乎丧失了对SGs的诱导作用,而TD1、TD55、TD254突变体仍然能在一定程度上诱导SGs形成。之后本研究通过Western Blot实验发现,Tax的TD99、TD254、TD319突变体相较于野生型而言,对PKR和eIF2α磷酸化水平的诱导显著降低。最后,本研究运用免疫共沉淀实验检测Tax突变体对于PKR二聚化的影响。实验结果表明Tax的TD99和TD150突变体几乎丧失了对PKR二聚化的促进作用,这也和免疫荧光结果基本一致。综合以上结果,本研究发现Tax主要通过氨基酸99-142、150-198区段结构域在促进PKR磷酸化,进而诱导SGs过程中发挥重要功能。 第四部分:表达Tax的宿主细胞通过形成SGs抑制细胞翻译及病毒复制 为了探究Tax对SGs调控的生理意义,本研究通过Puromycin渗入实验检测SGs的形成对于宿主细胞翻译的影响。实验结果表明Tax诱导产生SGs的细胞相较于对照组细胞而言,Puromycin信号更弱,该结果提示Tax诱导产生的SGs能够抑制宿主的翻译。随后利用流式细胞术检测Tax对VSV-eGFP模式病毒复制的影响。结果显示Tax能抑制VSV-eGFP模式病毒的复制。以上研究表明,表达Tax后,宿主细胞会通过形成SGs,抑制细胞翻译和病毒复制。 综上所述,本课题发现了 HTLV-1病毒Tax蛋白表达后可以诱导SGs的形成,并且SGs的形成呈现一定的动态变化,即在Tax表达前期诱导SGs形成,在后期促进SGs解聚。分子机制研究显示,Tax通过诱导PACT和TRBP异二聚化以及PKP二聚化等方式实现PKR和eIF2α磷酸化水平上调,进而诱导SGs的产生。此外,Tax通过99-142和150-198区段氨基酸在诱导SGs的形成方面发挥重要作用。据此本研究推测,HTLV-1病毒感染后,宿主细胞识别病毒Tax蛋白,从而诱导SGs形成。宿主通过SGs抑制细胞内翻译系统,从而实现抑制病毒复制的功能。本课题通过研究Tax对宿主细胞应激颗粒动态变化的调控,为深入研究HTLV-1与宿主细胞之间的相互作用提供新的思路,为揭示ATL的发生机制提供新的线索。
关
键
词：
人类T细胞白血病病毒1型; 应激颗粒; PKR蛋白; Tax蛋白; eIF2α
学
位
年
度：
2023
学
位
类
型：
硕士
学
科
专
业：
生物化学与分子生物学
导
师：
中
图
分
类
号：
R373[人体病毒学（致病病毒）]
学
科
分
类
号：
100103[病原生物学];100601[中西医结合基础医学]
D
O
I：
10.27464/d.cnki.gzsfu.2023.002432
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