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功能化有机分子的制备及其对耐药菌的检测和抗菌性能的研究认领

作者：

田亚飞

学位授予单位：

山西医科大学

摘要：

目的:细菌感染对公共健康造成了严重的威胁,抗生素是治疗的有效手段。但由于抗生素的长期误用和滥用,导致细菌对抗生素产生耐药性,到2050年,预计每年因抗生素耐药性造成的死亡人数为1000万人。耐药性已成为21世纪主要的公共卫生威胁之一。耐药菌的检测对于指导用药的种类、时间和剂量具有重要的意义,可延缓耐药菌的出现。但是,目前对于耐药细菌检测存在耗时长、操作繁琐和仪器昂贵等缺陷。荧光探针具有灵敏度高、响应速度快、操作简单等优点,已成为生命科学领域中最重要的分析工具之一。此外,开发有效的治疗策略是延缓和遏制耐药菌的另一个有效途径。近年来,抗菌光动力疗法（a PDT）和抗菌光热疗法（a PTT）由于具有低的毒性、高的生物安全性、广谱的抗菌活性和可忽略的耐药性,已成为对抗耐药菌的有效策略。单一的a PDT和a PTT都有其不可避免的缺陷,且a PTT产生的热难免会对周围的组织造成损伤。a PTT和a PDT协同治疗集成了二者的优点,有望克服a PTT的热休克效应和a PDT感染微环境的缺氧性。因此,本论文主要设计合成近红外荧光探针用于快速、高效的检测耐药菌;合成细菌感染酸性微环境响应的多功能光敏材料,在激光照射下,a PDT和a PTT协同高效清除耐药菌,主要工作如下:1.设计合成了检测β-内酰胺酶（β-lactamase）的近红外荧光探针ASC-BL,探索了ASC-BL探针对β-lactamase的检测性能,并在细菌层面研究其监测耐药菌的能力,预期为耐药细菌感染的快速精确检测开发新的技术手段。2.合成了细菌感染酸性微环境响应的有机分子ASC-Le,测试其在不同p H条件下的光热性能和光动力性能,研究其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）及其形成的生物膜的杀灭破坏性能,最后在活体层面上评估其治疗伤口感染的能力,试图为耐药菌感染的治疗提供一种新的方法和策略。方法:1.以2,3,3-三甲基-3H-吲哚、3-溴丙酸、2-氯-3-甲酰基环己-2-烯-1-羧酸、乙酸钠、乙酸酐、3-羟基苯硫酚和碳酸钾为原料经三步合成近红外荧光团ASC,然后以4-甲氧基苄基（7S）-3-（氯甲基）-8-氧代-7-（2-苯基乙酰胺）-5-噻-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸酯和ASC为原料经亲核取代反应得到荧光探针前体化合物。接着在以苯甲醚、三氟乙酸和二氯甲烷为脱保护剂将前体化合物的保护基团脱去,得到近红外荧光探针ASC-BL。利用高分辨质谱、核磁氢谱和碳谱对近红外荧光探针ASC-BL的结构进行了表征。通过紫外-可见分光光度计（UV-Vis）、荧光光谱仪和质谱仪研究了近红外荧光探针ASC-BL对β-lactamase的检测性能。利用分子对接、理论计算和反应液质谱研究了近红外荧光探针ASC-BL响应β-lactamase的机制。运用MTT实验检测了ASC-BL的生物安全性。进一步,利用UV-Vis和荧光光谱仪测试ASC-BL体外检测耐药菌的能力。在细菌层面上,利用激光共聚焦显微镜（LSCM）来研究ASC-BL对耐β-内酰胺耐药菌的成像检测能力。2.以N-（叔丁氧羰基）-L-亮氨酸一水合物、对氨基苯甲醇和三溴化磷为原料经过两步合成丁基(1-((4-（溴甲基）苯基)氨基)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)氨基甲酸酯。以丁基(1-((4-（溴甲基）苯基)氨基)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)氨基甲酸酯和ASC为原料通过亲核取代反应合成（E）-2-(2-(6-((4-(2-(（叔丁氧基羰基）氨基)-4-甲基戊酰胺基)苄基)氧基)-2,3-二氢-1H-噻吨-4-基)乙烯基)-1-（2-羧乙基）-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-鎓前体化合物。最后以三氟乙酸为脱保护剂,二氯甲烷为溶剂,脱去保护基团,得到化合物ASC-Le。利用高分辨质谱、核磁氢谱和碳谱对ASC-Le进行了结构表征。通过测定ASC-Le在不同p H条件下的紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）和荧光光谱来研究其光学性能。利用红外热成像仪测定不同p H条件下ASC-Le的光热性能。利用660 nm激光器和荧光光谱仪来研究ASC-Le产生活性氧（ROS）的能力。采用稀释涂布平板法来研究ASC-Le对MRSA及其生物膜的破坏和抗菌性能。最后,在动物水平上,通过感染伤口的大小、小鼠体重和病理切片来评估ASC-Le的抗MRSA感染性能和生物安全性。结果:1.合成的近红外荧光探针ASC-BL有宽的吸收峰,且最大吸收波长位于705nm;探针ASC-BL的荧光发射波长为763 nm。探针可以高选择性和灵敏性地响应β-lactamase,并且表现出良好的荧光增强效应,且响应时间为7 min,可用于耐药细菌的快速检测。同时测得β-lactamase的米氏常数（Km）为1.79μM,细菌水平的实验显示探针ASC-BL可以很好地对产生β-lactamase的耐药细菌进行检测和成像。2.合成的多功能光敏分子ASC-Le在激光照射下同时具有产生ROS和热的性能,并且在酸性环境中可增强其产生ROS和热。与正常的生理环境p H 7.4相比,ASC-Le在酸性环境中（p H 5.5）温度可升高10~oC。稀释涂布平板法、STYO-9/PI染色和生物膜结晶紫染色显示ASC-Le具有良好的协同清除MRSA生物膜和抗MRSA的性能。在动物水平上,ASC-Le可以杀灭感染部位的MRSA,并且伤口愈合良好,同时对小鼠主要的脏器无影响。结论:本论文以半花菁骨架ASC为母体分别合成了检测耐药菌的近红外荧光探针ASC-BL和具有PTT/PDT协同抗菌作用的细菌感染酸性微环境响应型有机功能分子ASC-Le。以耐药菌中的β-lactamase为生物标志物,探针ASC-BL显示出高的灵敏性和选择性,并且发射波长达到763 nm,可以快速精准检测耐药菌。ASC-Le可以响应酸性微环境增强PTT/PDT,可以杀死MRSA及其形成的生物膜,但是对正常组织损伤较小,在耐药细菌治疗中具有广阔的应用前景。

摘要译文

关键词：

有机功能分子; β-内酰胺酶; pH响应; 耐药菌

学位年度：

2023

学位类型：

硕士

学科专业：

生物化学与分子生物学

导师：

刁海鹏

中图分类号：

O657.3[光化学分析法（光谱分析法）⑨];R318.08[生物材料学]

学科分类号：

070302[分析化学];070306[化学生物学];081704[应用化学];081706[分子化工];081707[材料化工]

D O I：

10.27288/d.cnki.gsxyu.2023.000306