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产胞外多糖乳酸菌的筛选及其多糖的分离纯化、结构和生物活性研究认领

被引量： 1

作者：

周佳豪

学位授予单位：

湖南农业大学

摘要：

乳酸菌胞外多糖(LAB EPS)是乳酸菌在生长代谢过程中产生的一类糖类化合物的总称,其不仅具有优良的流变特性,还具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、降血脂等生物活性,引起研究者的广泛关注。本课题从实验室前期分离保藏的乳酸菌中筛选出高产胞外多糖且基础益生性能良好的菌株,研究菌株粗胞外多糖的生物活性,选择一种粗胞外多糖对其进行分离纯化,并对纯化后组分的化学成分、结构及生物活性进行进一步研究。(1)采用菌落拉丝法与苯酚-硫酸法从40株乳酸菌中筛选得到10株胞外多糖产量较高的菌株;通过酸耐受性(pH=2)、胆盐耐受性(3.0 g/L)试验、胃肠液耐受性试验,发现有6株乳酸菌的耐酸耐胆盐能力良好,且菌株在模拟胃肠液中的存活率均大于75%;乳酸菌赖氨酸脱羧酶活性、溶血性与抗生素敏感性实验结果表明10株菌株初步判定为安全。综合上述实验结果,选取4株菌进行下一阶段实验,通过16S r DNA测序鉴定为2株副干酪乳杆菌(LZ9089、LZ9Y10)、1株干酪乳杆菌(LZ9183)、1株短乳杆菌(LZ9285)。(2)提取所筛选菌株的粗胞外多糖,采用牛津杯法评价粗多糖的抑菌活性,通过透明质酸酶实验评价抗过敏活性,对粗多糖的体外抗氧化活性及对肿瘤细胞活性抑制率进行评价,使用RAW264.7巨噬细胞评价粗多糖的免疫调节活性。实验结果表明:四种胞外多糖对大肠杆菌具有一定的抑制能力,其中LZ9089 ESP的100μg/mL溶液的抑菌圈直径最大,达到17.54±2.53 mm;多糖高剂量组透明质酸活性抑制率较高,LZ9183 EPS在浓度为500μg/mL时,透明质酸酶抑制率达到62.16±6.5%;多糖的羟基自由基清除能力较强,浓度为1000μg/mL时羟基清除率顺序为:LZ9183 EPS>LZ9Y10 EPS>LZ9089 EPS>LZ9285 EPS,且能够与Vc的羟基自由基清除率相接近;仅有LZ9285 EPS对Caco-2细胞和Hep G2细胞的具有较弱的抑制作用,但其抑制能力远低于阳性对照5-FU组;四种胞外多糖对RAW264.7巨噬细胞的增殖都有一定的提升,LZ9183 EPS在500μg/mL时增殖率最高为115.64±1.43%,LZ9183 EPS与285 EPS在浓度为1000μg/mL时NO浓度明显高于阳性对照LPS组,LZ9Y10 EPS与LZ9183 EPS在浓度为1000μg/mL时吞噬率最高,分别达到空白对照的137.37±0.23%和131.86±0.84%。综合菌株基础益生特性、胞外多糖产量及生物活性研究结果,选择干酪乳杆菌LZ9183 EPS进行分离纯化,研究其化学组成、结构及抗过敏活性。(3)LZ9183 EPS通过离子交换层析柱与凝胶色谱柱得到两个单一组分LZEPS-1与LZEPS-2。化学组成分析与紫外光谱分析结果表明LZ9183 EPS与LZEPS-2中含有蛋白质,含量分别为4.94%与1.72%;采用HPGPC与离子色谱法测定多糖组分的分子量与单糖组成,结果显示LZEPS-1与LZEPS-2分子量分别为28.73 k Da与95.58 k Da,LZEPS-1由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖与甘露糖组成,摩尔比为4.44:4.37:86.32:4.87,LZEPS-2由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖与葡萄糖醛酸组成,摩尔比为31.67:8.32:0.64:56.72:2.33:0.32;通过红外光谱分析发现LZEPS-1与LZEPS-2均具有典型的多糖特殊吸收峰,进一步证明了LZEPS-1中含有吡喃糖苷,LZEPS-2中含有蛋白质、甘露糖与糖醛酸。(4)通过RBL-2H3细胞脱颗粒模型研究LZ9183 EPS、LZEPS-1与LZEPS-2的抗过敏活性,结果表明:粗多糖与多糖组分均能有效抑制β-HEX的释放,组分LZEPS-1在500μg/mL时的抑制率最高,达到52.293±0.153%,各组别HIS释放水平接近于正常组,IL-4的释放量近于阳性对照组,TNF-α的释放量也明显低于模型组,其中组分LZEPS-1作用较为显著,能够有效缓解Ig E介导的过敏反应,具备潜在的抗过敏活性。

摘要译文

关键词：

乳酸菌; 胞外多糖; 干酪乳杆菌; 生物活性; 结构

学位年度：

2022

学位类型：

硕士

学科专业：

农产品加工及贮藏工程（专业学位）

导师：

刘成国

中图分类号：

TS201.3[食品微生物学]

学科分类号：

082202[发酵工程];083201[食品科学];083606[微生物发酵工程]

D O I：

10.27136/d.cnki.ghunu.2022.000894