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茯砖茶中冠突曲霉胞内外多糖的免疫调节功能及其维持肠道稳态的研究认领

作者：

谢志勇

学位授予单位：

南京农业大学

摘要：

茯砖茶是一种有400多年历史的黑茶,具有降脂减肥、降血糖、保肝、免疫调节等多种有益人体健康的作用。作为一种后发酵茶产品,其独特的发酵工艺称为“发花”。冠突曲霉(Aspergillus cristatus)被称为“金花菌”,是参与茯砖茶发酵的主要真菌,对茶叶的感官品质和保健品质的影响很大,其数量是茯砖茶质量的重要指标。冠突曲霉胞外多糖(EPSs)和胞内多糖(IPSs)作为可能存在于茯砖茶中的重要生物活性物质,目前相关研究还很有限,仅限于一些提取优化、理化性质以及抗氧化、降脂和抗肿瘤活性等初步研究。然而,冠突曲霉EPSs和IPSs在体内对机体免疫系统和肠道菌群的影响尚未见报道。目前,对冠突曲霉EPSs/IPSs、免疫系统和肠道菌群之间的相互作用的关系还不清楚。因此,本研究首先将EPSs和IPSs分离纯化,对其理化性质、初步结构及其体外免疫调节活性进行简要分析。然后聚焦冠突曲霉EPSs和IPSs对免疫抑制小鼠的免疫功能及肠道菌群的调节作用,并进一步研究EPSs和IPSs对结肠炎的缓解作用及其对肠道屏障功能的调节,深入探讨其在调节免疫反应和维持肠道稳态中的作用。主要结果如下:1.EPSs和IPSs的分离纯化、理化性质及其体外免疫调节活性本实验采用水提醇沉法和超声波辅助提取法从冠突曲霉发酵液和菌丝体中分别提取出胞外和胞内粗多糖(CEPSs和CIPSs),经Sevage法、透析等步骤除去蛋白及各种小分子杂质后,通过DEAE Fast Flow阴离子交换柱层析纯化得到其对应的两个主要纯化组分EPSs-2和IPSs-2。EPSs和IPSs总糖含量较高,主要为中性多糖,其中EPSs相比于IPSs含更高的糖醛酸,而IPSs-2几乎不含糖醛酸。经纯化后,EPSs-2和IPSs-2的总糖含量显著提高,其蛋白及多酚含量显著降低。EPSs和IPSs均是主要由甘露糖和半乳糖组成的杂多糖,EPSs-2的单糖组成摩尔比为甘露糖:核糖:葡萄糖醛酸:葡萄糖:半乳糖=4.3:0.5:0.4:1.2:3.6,IPSs-2的单糖组成摩尔比为甘露糖:核糖:葡萄糖:半乳糖=4.4:0.4:1.1:4.1。EPSs-2和IPSs-2的平均分子量分别为5.60、17.98 k Da。EPSs和IPSs都具有良好的热稳定性。此外,以小鼠巨噬细胞RAW264.7为细胞模型,对EPSs-2的体外免疫调节活性进行了初步评价。发现EPSs-2对RAW264.7细胞无明显的细胞毒性,并且能够显著促进细胞对NO、TNF-α和IL-6的分泌并呈现明显的剂量关系,表明EPSs-2在体外对RAW264.7细胞具有良好的免疫调节作用。2.EPSs和IPSs的免疫调节功能及其对肠道菌群的调节作用采用环磷酰胺(Cy)诱导的免疫抑制小鼠模型评价EPSs和IPSs对机体免疫功能和肠道菌群的调节作用。结果表明EPSs-2、CIPSs和IPSs-2对Cy诱导的免疫抑制小鼠具有较强的免疫调节作用,其中,EPSs-2作为主要纯化组分,比CEPSs具有更有效的活性,而CIPSs和IPSs-2的差异不明显。主要表现在小鼠体重和日采食量的恢复,免疫器官指数(胸腺指数、脾脏指数)的增加,血清中细胞因子和免疫球蛋白(TNF-α、IL-1β、IFN-γ和Ig A)水平显著提高。通过对空肠和结肠病理分析发现,EPSs和IPSs干预可减轻Cy诱导的空肠和结肠组织损伤,显著增加空肠的绒毛长度及绒毛长度/隐窝深度比值(V/C),促进结肠中紧密连接蛋白(ZO-1、Occludin、Claudin-1)和粘蛋白(MUC2)的表达,增强肠道屏障功能和黏膜免疫。同时,EPSs和IPSs干预可显著增加不同种类的短链脂肪酸(SCFAs)的产生,并且EPSs-2和IPSs-2干预显著上调了结肠中SCFAs受体(GPR41、GPR43)和细胞因子(TNF-α、IL-6、IFN-γ)的表达。此外,EPSs和IPSs干预可以平衡Cy诱导的小鼠肠道菌群的紊乱,其中,EPSs主要通过促进Muribaculaceae、Prevotellaceae＿UCG-001、Bacteroides、Parabacteroides和Tidjanibacter的生长,降低Helicobacter、Bilophila、Mucispirillum、Lachnospiraceae、Ruminococcaceae和Clostridiales的相对丰度,从而调节菌群结构。IPSs通过促进与免疫指标呈正相关的益生菌Muribaculaceae、Muribaculum、Duncaniella＿muris、Bacteroides acidifaciens、Parabacteroides、Barnesiella的生长,抑制与免疫指标呈负相关的条件致病菌Lachnospiraceae、Ruminococcaceae、Clostridiales、Bilophila、Helicobacter、Mucispirillum＿schaedleri的生长,从而维持肠道微生态平衡。3.EPSs和IPSs对小鼠结肠炎症的缓解及肠道屏障功能的调节通过建立葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎小鼠模型,研究EPSs和IPSs干预对小鼠结肠炎的缓解作用及其对肠道屏障功能的调节作用。结果表明,EPSs-2、CIPSs和IPSs-2干预对改善小鼠结肠炎的具有较强的作用,尤其是IPSs-2具有更有效的活性。主要表现在能够恢复小鼠的体重、固态粪便的形态、颜色和质量,改善结肠形态并抑制结肠萎缩等症状,并显著抑制粪便中Lcn-2水平,显著降低血清中TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-6和LPS的含量,上调小鼠结肠组织中抗炎性因子IL-10和下调炎症相关基因TNF-α、IL-1β、i NOS和TLR4的表达。另外,EPSs和IPSs对小鼠结肠炎的缓解作用与其肠道屏障功能的调节密切相关,EPSs-2和IPSs对结肠的病理损伤具有明显的缓解作用,并改善DSS诱导的杯状细胞减少和粘液产生缺陷,增强ZO-1、Occludin、Claudin-1和MUC2的m RNA水平的表达,促进紧密连接蛋白和粘蛋白的产生,从而增强肠道屏障功能及肠道粘膜免疫。同时,EPSs-2和IPSs干预显著促进SCFAs产生,并上调SCFAs主要受体GPR43、GPR41和GPR109A的m RNA表达,在维持肠道屏障功能和缓解结肠炎中发挥重要作用。

摘要译文

关键词：

冠突曲霉; 胞内外多糖; 免疫调节; 肠道菌群; 结肠炎; 肠道屏障功能

学位年度：

2021

学位类型：

硕士

学科专业：

食品科学与工程

导师：

曾晓雄

中图分类号：

TS272.5[各种茶];TS201.4[食品营养学]

学科分类号：

0822[轻工技术与工程];083202[农产品加工及贮藏工程];090204[茶学];083201[食品科学];083205[食品营养]

D O I：

10.27244/d.cnki.gnjnu.2021.000618