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基于计算机模拟和SPR传感策略的大球盖菇多功能鲜味肽筛选及其活性分子作用机制解析认领

作者：

李佳霖

学位授予单位：

兰州理工大学

摘要：

鲜味肽作为一种新型调味剂,符合“天然、营养和安全”的食品开发理念。鲜味肽除了具有良好的口感外,还具有一定的功能特性。因此,从食源性衍生蛋白中发现和鉴定新型鲜味肽越来越受到人们的关注。大球盖菇（Stropharia rugosoannulata）作为一种药食兼用的食用菌,其味道鲜美、风味独特、营养丰富。在前期实验中,我们发现大球盖菇干基中的游离肽可达到148.65～167.32 mg/g,优质的多肽含量为鲜味肽的挖掘提供了可靠原料。本研究以实验室前期工作为基础,对前期分离纯化制备的大球盖菇水提鲜味富集组分进行质谱结构鉴定,构建大球盖菇多肽数据库;基于该数据库利用计算机虚拟筛选技术筛选出兼具潜在血管紧张素转化酶（Angiotensin-converting enzyme,ACE）和二肽基肽酶Ⅳ（Dipeptidyl peptidase-Ⅳ,DPP-Ⅳ）抑制活性的鲜味肽;化学合成鉴定鲜味肽并系统研究其味觉属性;通过分子对接探究鲜味肽与hT1R1/T1R3鲜味受体的分子作用机制,以揭示合成肽的呈鲜机理;基于hT1R3受体模块,构建仿生味觉传感器,探究合成肽与hT1R3的靶向互作模式,以实现鲜味肽的快速鉴定;并对合成肽的ACE、DPP-Ⅳ抑制活性及作用机制进行进一步探究;实验结果为多功能鲜味肽的快速筛选、鉴定提供了新策略,亦为大球盖菇深加工产品的多维度开发利用提供理论依据。具体研究结果如下:1.大球盖菇多肽库的建立及通过计算机辅助筛选获得潜在多功能鲜味肽通过UHPLC-Q-Orbitrap-MS/MS从大球盖菇水提鲜味富集组分中鉴定得到123条多肽,以此构建了大球盖菇多肽基础数据库。该肽库由19种氨基酸构成,其中Leu、Pro、Ser、Glu、Ala出现频率较高,这为多肽的呈鲜及功能活性挖掘提供了有利条件。基于同源建模成功构建了高质量的人源鲜味受体hT1R1/T1R3蛋白模型;通过在线预测工具和分子对接筛选得到23条兼具ACE和DPP-Ⅳ抑制活性的鲜味肽,根据分子对接能量最低及氨基酸组成相似等特征,从不同肽链长度的多肽中挑选最具潜力的12条多肽进行固相合成。2.合成肽的味觉特性解析及其与鲜味受体的hT1R1/T1R3分子作用机理研究固相合成已鉴定的12条鲜味肽。感官评价结合电子舌结果表明,12条合成肽的鲜味阈值范围为0.105 m M～0.728 m M高于传统鲜味剂MSG,表现为高感受鲜味肽。12种合成鲜味肽对MSG表现出不同程度的增鲜效果,增鲜率为7.50～35.31%,MGPENGV的增鲜作用最强;在减盐12.5%的模型中,与相同质量浓度的Na Cl（0.4%）溶液相比,12条合成肽与Na Cl混合液体系的鲜味、咸味强度均有提升,鲜味强度增长1.91～3.19倍,DGFASD增鲜效果最强,咸味强度增长1.29～2.27倍,EPQDC增咸效果最强。合成肽与等质量比的氨基酸混合物的滋味特性存在明显差异,表明鲜味肽的鲜味强度不是由单一氨基酸的滋味简单叠加形成的,而是由氨基酸通过肽键形成特定序列及结构决定的;鲜味氨基酸、甜味氨基酸及疏水性氨基酸的存在可促进鲜味的表达,且当C端为鲜味氨基酸时,鲜味肽通常拥有较低的鲜味阈值。分子对接结果显示,hT1R3为鲜味肽的主要识别区域,Ala302、Glu45、Ser146和His145为鲜味肽与hT1R3的关键结合位点,氢键和静电相互作用可促进鲜味的呈现。3.基于表面等离子共振技术（Surface plasmon resonance,SPR）探究合成肽与hT1R3的相互作用模式为便于高效筛选鲜味肽,构建了hT1R3生物传感芯片。通过SPR靶向互作分析,合成肽与hT1R3以“快上快下”作用模式结合。12条均被证实与hT1R3具有较强的亲和力,KD值范围为2.283×10-6M～8.066×10-5M,获得的亲和力与鲜味阈值呈现出较好的一致性,进一步佐证了分子对接结果,hT1R3亚基在人类识别鲜味感知中发挥着主要作用。通过动力学参数发现合成肽具有比MSG鲜味更持久的优势。该方法为鲜味肽的高效鉴定提供了新策略。4.合成肽体外ACE、DPP-Ⅳ抑制活性的测定及抑制机理解析体外活性测定结果表明,12条多肽均具有ACE抑制活性,IC50值范围为5.73±0.01μM～2111.49±5.77μM;EAF、EPQDC、EPQCD、SNGNE和MGPENGV同时表现出良好的DPP-Ⅳ抑制活性,IC50值为1099.03±7.59μM～2763.77±9.55μM,其中EAF表现出突出的ACE抑制和DPP-Ⅳ抑制双重活性。根据多肽结构特征发现,当多肽疏水性较高或带末端有负电荷时,可表现出更强的ACE抑制活性;具有N端第二个氨基酸为Ala或Pro结构特征的EAF、EPQDC和EPQCD表现出比SNGNE和MGPENGV更强的DPP-Ⅳ抑制活性。分子对接结果表明,抑制肽主要通过氢键、金属键及静电相互作用力与ACE关键作用位点Ala354、Tyr523、Lys511、His513及Zn2+结合而发挥其ACE抑制作用;DPP-Ⅳ抑制活性主要通过氢键、静电相互作用及疏水相互作用与DPP-Ⅳ关键作用位点His740、Tyr547、Glu205、Tyr662结合而发挥作用。

摘要译文

关键词：

鲜味肽; 大球盖菇; hT1R1/T1R3; ACE; DPP-Ⅳ; 分子对接; SPR

学位年度：

2023

学位类型：

硕士

学科专业：

生物工程

导师：

刘晓风杨焱

中图分类号：

TS264.3[食用香料、香精]

学科分类号：

082202[发酵工程];083202[农产品加工及贮藏工程]

D O I：

10.27206/d.cnki.ggsgu.2023.001582