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阿拉斯加鳕鱼皮ACE抑制肽的制备及其分离纯化认领

被引量： 1

作者：

杨贵兰

学位授予单位：

滨州医学院

摘要：

目的:以阿拉斯加鳕鱼皮为原料,筛选制备胶原多肽的最优工艺,对酶解液进行分离纯化,获得对血管紧张素转化酶(angiotensin-I converting enzyme,ACE)抑制活性较好且较稳定的活性肽。方法:采用酶解法制备得到鳕鱼皮酶解液并对其进行了工艺优化,得到的酶解液借助氨基酸分析仪和液相色谱-质谱联用仪(liquid chromatograph mass spectrometer,LC-MS)等进行结构分析。再将酶解液依次利用分子截留量分别为3k Da和10k Da的超滤管、葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)分子层析和高效液相色谱仪(high performance liquid chromatography,HPLC)进行分离纯化,得到纯度较高的ACE抑制肽。借助液相色谱-串联质谱法(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)和傅里叶变换红外色谱仪(fourier transform infrared spectrometer,FTIR)等对其进行了结构表征,同时研究了各组分的ACE抑制活性,并利用Auto Dock软件分析了ACE抑制肽与ACE的结合方式与作用位点。结果:(1)采用胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和复合蛋白酶等6种不同的蛋白酶对阿拉斯加鳕鱼皮进行酶解,并以ACE抑制率为评价标准,筛选得到酶解阿拉斯加鳕鱼皮制备ACE抑制肽的最优酶。考察料液比、酶与底物质量比、pH、酶解温度和时间等要素对ACE抑制肽的ACE抑制活性的影响。经多个单因素试验和正交试验确定了制备阿拉斯加鳕鱼皮ACE抑制肽的最优条件为:水解温度为40℃,反应2 h,料液比为1:7,酶与底物质量比为3%,pH为7。最优工艺的酶解液ACE抑制率为79.62%,分子量在500 Da以下的占总体的70.74%;酶解液中甘氨酸含量占比最高,为29.41%,脯氨酸含量次之,为16.11%。酶解液中还含有Ile、Leu、Met、Val、Phe、Lys、Thr 7种人体必需氨基酸,总的氨基酸含量占比为83%。(2)将阿拉斯加鳕鱼皮酶解液分别经分子截留量为3kDa和10k Da的超滤管分离后,获得小于3k Da、3k Da-10k Da和大于10k Da三种不同分子量的酶解液。体外对ACE的抑制作用结果表明:小于3k Da组分的ACE抑制率最高,50%抑制浓度(inhibit-concentration for50%,IC50)为 1.59±0.008 mg/mL。利用Sephadex G-25凝胶过滤色谱法对小于3k Da组分进一步纯化,获得6个不同的组分,其ACE抑制结果表明层析柱分离组分3(F3)活性最强,IC50值为0.25±0.012 mg/mL。再利用RP-HPLC对F3进一步纯化得到纯度较高的单一组分(纯化肽)。通过高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用技术(high performance liquid chromatography--Q-TOF-mass spectrometer,HPLC-Q-TOF-MS)对纯化肽进行序列分析,以纯化肽序列与ACE抑制活性之间的关系为基础,筛选得到4条ACE抑制肽序列,分别为GPLGVP、VLYPVK、VFLENVLR和FEEF。并利用固相合成法进行了从头合成,研究发现:GPLGVP的ACE抑制活性最强,分子量为538.31 Da,IC50值为105.8 μM。且通过BIOPEP数据库搜索后发现该序列为新型序列。FT-IR光谱显示纯化肽具有无规卷曲结构和β-折叠。Lineweaver-Burk图表明该肽为非竞争性抑制机制,说明抑制肽能够在其结合位点之外与酶结合。对胃肠蛋白酶稳定性的研究发现纯化肽在酶解前后抑制率分别为70.94%±0.37%和69.64%±0.25%,说明纯化肽对酶的敏感性较低。(3)以ACE的晶体结构(PDB:ID 108A)和ACE抑制肽GPLGVP分别为受体和配体分子,使用Auto Dock软件对其进行分子对接,研究发现:纯化肽GPLGVP可成功地对接在ACE的活性位点上。其中,GPLGVP的七个ACE残基(Gln281,Lys511,Tyr520,Glu162,His353,Cys370 和 Asp377)可与 ACE形成氢键。GPLGVP还能够与两个ACE活性口袋(S2和S10)中的至少一个残基相互作用。此外,纯化肽GPLGVP主要通过范德华力和氢键作用力结合ACE的活性位点。结论:海洋生物是提取生物活性肽的新来源,采用各种分离方法相结合的方式可获得纯度较高活性显著的活性肽。

摘要译文

关键词：

阿拉斯加鳕鱼皮; ACE抑制肽; 分离纯化; 结构鉴定; 分子对接

学位年度：

2021

学位类型：

硕士

学科专业：

药学

导师：

秦松王晓艳李文军

中图分类号：

TS254.9[水产副产品加工及利用]

学科分类号：

0822[轻工技术与工程];083204[水产品加工及贮藏工程];090808[水产品加工与质量安全]

D O I：

10.27749/d.cnki.gbzyx.2021.000099