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牛樟芝菌丝体抗肿瘤活性蛋白的分离纯化、体外作用机理与异源表达认领

被引量： 1

作者：

李颖颖

学位授予单位：

华中农业大学

摘要：

癌症是全球人口死亡的主要原因之一,每年新发和死亡病例都居高不下,严重危害了人民的生命健康,且一些恶性肿瘤一旦被发现大多已到晚期,预后差、生存率低,治疗困难。今年一月份国家药品监督管理局批准上市了首个中药原创药——淫羊藿素胶囊（阿可拉定）,在中国肝癌患者的临床治疗中表现出良好疗效,成为中药科技创新的典范。牛樟芝作为台湾特有的珍稀药用真菌,具有显著的抗肿瘤、抗炎等功效,目前已开展的相关研究主要围绕多糖、三萜、泛醌类等活性物质,针对蛋白质类抗肿瘤活性物质的研究较为缺乏。本研究在前期牛樟芝液态发酵优化的基础上,由菌丝体中分离纯化出活性蛋白,初步探究其发挥抗肿瘤活性的作用机制,并实现其在毕赤酵母中的重组表达,为后续规模化开发应用奠定基础。主要研究结果如下:1.通过单因素实验和正交设计优化牛樟芝菌丝体蛋白的提取方法,以Bradford法检测蛋白浓度,确定在4℃条件下,以Tris-HCl为提取缓冲液,1:20的料液比提取8 h,粗蛋白提取得率达到4.3%。2.利用硫酸铵盐析法将粗蛋白进行沉淀处理,再经阴离子交换色谱和凝胶过滤色谱纯化出活性蛋白;以洗脱组分的抗肿瘤活性为评价指标,筛选出具有显著抑制效果的活性蛋白（Antrodia cinnamomea active protein,ACAP）;单一蛋白条带经质谱鉴定后,通过氨基酸序列与牛樟芝转录组数据的比对,识别出目标基因序列为后续重组表达做准备。3.通过体外试验研究了ACAP对HeLa、Hep G2和Hepa 1-6等不同肿瘤细胞的抑制作用,发现ACAP在较低浓度下对这些肿瘤细胞均有显著性抑制效果,半抑制浓度IC50分别为13.10μg/mL、10.70μg/mL、18.69μg/mL。在此基础上,运用流式细胞仪检测Hep G2细胞的凋亡情况,进一步探究了ACAP抗肿瘤作用机制。结果表明,与对照组相比,ACAP主要诱导了Hep G2细胞的晚期凋亡,早期凋亡的比例较低;Western blot实验证实ACAP影响了细胞凋亡通路中相关蛋白的表达水平,如p53的表达水平显著上调,而下游caspase-3蛋白的表达水平明显下调。4.经质谱鉴定数据比对后,确定与牛樟芝转录组数据覆盖度最高的基因序列（记为ACAP-1）,生物信息学分析结果显示,ACAP-1CDS序列长1080bp,分子量大小约为50 kDa,理论pI为5.9;根据目的基因序列设计引物克隆得到目的片段,以pPIC9K质粒为载体构建重组质粒pPIC9K-ACAP,线性化后电转入毕赤酵母GS115菌株,通过不同浓度遗传霉素筛选得到高拷贝整合重组菌株,最后以甲醇诱导重组蛋白的表达,并初步证实了其抗肿瘤活性。

摘要译文

关键词：

牛樟芝活性蛋白; 抗肿瘤活性; 分离纯化; 细胞凋亡; 重组表达

学位年度：

2022

学位类型：

硕士

学科专业：

生物工程（专业学位）

导师：

梅余霞

中图分类号：

R285[中药药理学]

学科分类号：

100505[临床中药学];100801[中药资源学];100806[中药药理学];100808[临床中药学]

D O I：

10.27158/d.cnki.ghznu.2022.000395