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链霉菌甲壳素酶发酵工艺及酶学性质研究认领

被引量： 2

作者：

包雍宏

学位授予单位：

山东理工大学

摘要：

甲壳素是由N-乙酰氨基葡萄糖残基经过β-1,4糖苷键聚合而成一种天然碱性多糖,广泛存在于地球的水陆生态系统中,自然界中甲壳素的含量仅次于纤维素,它是许多真菌细胞壁和甲壳类动物外骨骼的重要组成部分,每年全球约产生1000亿t甲壳素。由于其结构中含有N元素,因此其降解产物可以作为许多化工业产品的基础物质,具有极高的商业价值。由于天然甲壳素结构紧密,溶解性极差,这大大限制了甲壳素的应用。但由甲壳素降解所得的甲壳低聚糖克服了这一缺点,具有良好的溶解性,还具有例如抗菌、抗氧化和抗肿瘤等生理活性,应用前景广泛。目前,工业上常用酸水解法制备甲壳素及其低聚物等附加产品,但这一方法操作过程复杂不易控制,产率低且容易对环境造成严重的污染,与之相比生物酶降解甲壳素反应条件温和,产品聚合度高且基本不会造成环境污染,因此采用专一性酶水解甲壳素制备其低聚物等附属产品成为研究的热点。自然界中,微生物是甲壳素专一性水解酶——甲壳素酶的重要生物来源,因此如何通过一定的实验手段优化微生物发酵产甲壳素酶的能力,并降低发酵产酶成本,以此来满足工业化生产甲壳素酶,这仍然是开发利用甲壳素资源的重要研究课题。本研究对筛选所得的一株可以产甲壳素酶的菌株Streptomyces No.6进行全基因组分析,从基因组遗传水平上深入了解该菌株的遗传背景信息以及如何降解利用甲壳素,并根据KEGG数据库的分析结果尝试构建了该菌株降解甲壳素的代谢网络,为后续对其进行基因改造奠定了基础。然后通过单因素对所得的菌株产甲壳素酶的发酵条件和发酵培养基进行优化,并根据单因素实验结果选择对产甲壳素酶有显著影响的三个因素进行响应面实验设计,对这三个因素的不同水平进行优化,进一步提高该菌株产甲壳素酶的能力。同时通过恒重法研究该菌株对粉末甲壳素的利用率,通过HPLC分析该甲壳素酶的降解产物。最后对发酵所得的发酵液进行硫酸铵盐析得到提纯后的酶液,并对该酶液进行酶学性质的研究,确定该菌株所产甲壳素酶的最适反应条件。实验结果如下:1、根据KEGG数据库的分析结果尝试构建了该菌株体内甲壳素的代谢网络,初步了解了甲壳素的代谢过程,为后续对其进行基因改造奠定基础。基于氨基酸序列分析构建了甲壳素酶的系统进化树,比较分析了其进化关系,筛选出两条具有重要研究价值的甲壳素酶基因GL001524和GL006593。2、Streptomyces No.6的最优发酵条件为:甲壳素0.5%,壳聚糖0.1%,（NH4）2SO40.5 g/L,Ca Cl2·2H2O 0.01 g/L,接种量为1.5%,初始p H值为5.5,发酵时间为144 h,发酵温度为28℃,发酵转速为400 rpm/min,优化后的酶活为6.3756 U/m L。3、发现随着发酵时间的增长,甲壳素的利用率逐渐增长,在发酵168 h后,甲壳素利用率达到43.15%。HPLC实验结果显示Streptomyces No.6发酵所产甲壳素酶的水解产物中含有还有大量的（Glc NAc）5、（Glc NAc）3、Glc NAc以及少量的（Glc NAc）2,由此可以推测Streptomyces No.6发酵产生的甲壳素酶可以降解甲壳素为多种甲壳寡糖。4、得到该酶的特性如下:最适反应温度为65℃,最适反应p H值是5,表示该甲壳素酶是酸性甲壳素酶;温度稳定范围是35℃-70℃,p H值稳定范围是p H 4-p H 8,最适反应底物是胶体甲壳素;金属离子对该甲壳素酶活性影响不是很显著,与其他金属离子相比,Zn2+可以提高甲壳素酶活性,但效果不是很显著,EDTA和Tween-80对该甲壳素酶活性的影响不是很显著,但SDS对该甲壳素酶具有显著的抑制作用。

摘要译文

关键词：

链霉菌; 甲壳素酶; 全基因组测序; 发酵优化

学位年度：

2022

学位类型：

硕士

学科专业：

食品工程（专业学位）

导师：

宋元达

中图分类号：

TQ925[酶制剂（酵素）]

学科分类号：

081703[生物化工];082202[发酵工程];083604[生物过程工程];083606[微生物发酵工程]

D O I：

10.27276/d.cnki.gsdgc.2022.000312