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基于“谱-效”关系探究芪玉三龙汤抗氧化及抑制A549细胞增殖的效应物质基础认领

被引量： 2

作者：

黄梦文

学位授予单位：

安徽中医药大学

摘要：

目的:利用超高效液相色谱-四极杆/飞行时间-质谱（UPLC-Q/TOF-MS）技术分析芪玉三龙汤（Qi-Yu-San-Long Decoction,QYSLD）的化学物质基础;通过“谱-效”关系探究QYSLD中发挥抗氧化作用及抑制A549细胞作用的活性成分群。方法:首先,利用UPLC-Q/TOF-MS的全信息扫描技术（MSE模式）结合靶向筛查方法对QYSLD中的化学成分进行分析。然后,利用正交试验设计方法共煎煮10批QYSLD样品;通过1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和铁离子还原法（FRAP）实验评估10批QYSLD的抗氧化活性;通过CCK-8考察10批QYSLD抑制A549细胞增殖活性水平,采用细胞划痕实验和transwell小室法评估QYSLD抑制A549细胞横向迁移、纵向迁移和侵袭的能力;最后利用UPLC-Q/TOF-MS技术建立10批QYSLD的指纹图谱;通过三种数据处理方法,即灰色关联度分析（GRA）、偏最小二乘回归（PLSR）和反向传播神经网络（BP-ANN）模型结合平均影响值（MIV）算法将UPLC-Q/TOF-MS指纹图谱与药效相关联,进而分别筛选出QYSLD中发挥抗氧化及抑制A549细胞增殖的活性成分群;最后,对谱效关系筛选出的部分活性成分进行验证,同时对未能入选活性成分的部分化学成分也予以验证。结果:1 QYSLD中化学成分的快速辨识采用UPLC-Q/TOF-MS结合靶向筛查方法,从QYSLD中共识别出166种化学成分,包括皂苷类22种、生物碱类13种、黄酮类27种、萜类32种、氨基酸类20种、苯丙素类16种、有机酸类9种、甾醇类6种、蒽醌类6种、其他类15种,其中有16种化学成分经对照品予以确认。2 QYSLD抗氧化和抑制A549细胞增殖的活性评价（1）QYSLD（S1～S10）具有不同程度的抗氧化能力,其IC50值和FRAP值的范围分别为1.591～5.504 mg·m L-1和143.83～873.83μmol·L-1。（2）不同浓度(0～100 mg·m L-1)的QYSLD（S10）分别作用A549细胞12、24和48 h的IC50值分别为40.45,22.56和17.13 mg·m L-1。以20 mg·m L-1作用24h作为给药浓度和孵育时间来评价10批QYSLD（S1～S10）对A549细胞增殖的抑制作用,结果显示10批QYSLD均能不同程度的抑制A549细胞增殖（P<0.05）,细胞存活率的范围为21.73%～85.71%。与对照组相比,10批QYSLD给药组均具有明显抑制A549细胞横向迁移的能力（P<0.01）,相对划痕面积愈合率的范围为21.50%～44.46%。Transwell体外迁移和侵袭实验结果显示,与对照组相比,10批QYSLD给药组中穿过聚碳酸酯膜、覆盖着Matrigel胶的聚碳酸酯膜的A549细胞个数均明显减少（P<0.01）,提示10批QYSLD给药组能显著抑制A549细胞的纵向迁移和侵袭能力。3 QYSLD中抗氧化和抑制A549细胞增殖的活性成分群筛选（1）利用UPLC-Q/TOF-MS成功建立了QYSLD指纹图谱,精密度、重复性及稳定性实验的RSD均小于11.82%,表明方法稳定可行;相似度评价结果显示,10批QYSLD的UPLC-Q/TOF-MS指纹图谱与参照图谱的相似度均大于0.797。（2）综合运用GRA、PLSR和BP-ANN模型结合MIV算法评价活性成分群,结果显示:（1）去乙酰车叶草苷酸（P4）、泽漆新苷（P24）等8种成分与DPPH自由基清除能力密切相关;（2）去乙酰车叶草苷酸（P4）、水晶兰苷（P7）等9种成分与FRAP实验结果密切相关;（3）去乙酰车叶草苷酸（P4）、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷（P28）等6种成分与抑制A549细胞增殖能力有关;（4）对香豆酸（P23）、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷（P28）等22种成分与抑制A549细胞横向迁移能力有关;（5）泽漆新苷（P24）、澳洲茄边碱（P44）等5种成分与抑制A549细胞纵向迁移能力有关;（6）车叶草苷酸（P16）、对香豆酸（P23）等12种成分与抑制A549细胞侵袭能力有关;（3）验证性实验结果表明:与未能入选活性成分的贝母辛和黄芪皂苷II相比,谱效关系筛选出的活性成分如毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷和去乙酰车叶草苷酸均具有更好的DPPH自由基清除能力;同样,与贝母辛和黄芪皂苷II相比,水晶兰苷和去乙酰车叶草苷酸显示出较好的铁离子还原能力;另外,通过CCK8验证实验结果表明活性成分如毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、莪术醇和澳洲茄边碱均表现出更好的抑制A549细胞增殖的作用,而未能入选活性成分的绿原酸对A549细胞的抑制作用较弱。结论:本研究从QYSLD中辨识出166种化学成分;基于UPLC-Q/TOF-MS成功构建了QYSLD的指纹图谱,不同批次的QYSLD具有不同水平的抗氧化及抑制A549细胞的能力,通过GRA、PLSR和BP-ANN模型结合MIV算法将“谱”与“效”相关联,筛选出QYSLD中发挥抗氧化作用及抑制A549细胞增殖的活性成分群并进行验证。本研究揭示了QYSLD中抗氧化及抑制A549细胞增殖的效应物质基础。

摘要译文

关键词：

芪玉三龙汤; A549细胞; UPLC-Q/TOF-MS指纹图谱; 谱效关系; 活性成分群

学位年度：

2022

学位类型：

硕士

学科专业：

药物分析学

导师：

吴欢

中图分类号：

R285[中药药理学]

学科分类号：

100505[临床中药学];100801[中药资源学];100806[中药药理学];100808[临床中药学]

D O I：

10.26922/d.cnki.ganzc.2022.000166