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DNA醛基修饰的荧光探针设计及应用研究认领

作者：

李娜

学位授予单位：

四川大学

摘要：

DNA分子通过A、T、C和G的碱基序列来编码生物体内的遗传信息。除了这四种传统的基础碱基外,DNA分子中还存在着上百种稀有碱基。其中,DNA醛基修饰,包括5-醛基尿嘧啶(5-formylurail,简称5f U)、5-醛基胞嘧啶(5-formylcytosine,简称5f C)和脱碱基位点(abasic sites,简称AP),介导了基因调控、基因组印迹、细胞分化和X染色体失活等多种生物学过程。因此,定性和定量检测该类醛基化碱基对研究其表观遗传学功能具有重大意义。在本文中,我们主要设计并合成了一系列小分子荧光探针用于DNA醛基修饰的定性和定量分析。 (1)2-氨基苄胺肟衍生物定性和定量检测DNA醛基修饰:基于2-氨基苄胺肟(ABAO)骨架的醛基反应性探针能够通过分子内环化在温和的条件下选择性标记DNA上的醛基。通过ABAO衍生物与AP反应后的荧光筛选,我们锁定了探针5-甲氧基-ABAO(PMA),其能够实现对醛基修饰的高效检测。通过荧光光谱和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验,我们证明了PMA能够选择性地与5f U、5f C和AP反应生成荧光二氢喹唑啉衍生物。最后,我们将PMA应用到γ-射线辐射过的小牛胸腺DNA中,实现对实际DNA样品中醛基修饰的定量分析。 (2)2,3,3-三甲基吲哚衍生物基于荧光共振能量转移机理检测5-醛基尿嘧啶:我们期望构筑基于荧光共振能量转移(FRET)机理的5f U比率型荧光探针。因此,我们设计了以2,3,3-三甲基吲哚为骨架的两类目标探针:(1)L-A、LB、L-C和(2)L-N、L-M,通过磺酸基团的引入与否来比较其对5f U标记的影响。但遗憾的是,经过多次尝试后我们并未得到含有磺酸基团的探针L-A、L-B和L-C。随后,我们继续合成无磺酸基团的探针L-N和L-M并最终成功获得目标化合物。但由于亲水基团的缺失,这两个探针的水溶性是一个问题。我们首先测试了L-N和L-M的紫外吸收光谱和荧光发射光谱,并根据两者的溶剂效应和p H效应进行光谱筛选。最后,我们通过液相色谱分析法对探针标记5f U的反应条件进行了优化,但均未实现预期效果。 (3)基于Mannich反应的DNA醛基化检测方法:我们首先尝试Mannich反应标记5f U的可能性。经过对5f U、胺和活泼氢化合物近80种不同组合的薄层色谱筛选,我们初步得到三组最佳的标记条件。但是这三者在进行扩量反应和选择性实验时,存在难以纯化和核苷选择性差的问题,难以用于5f U后续功能化的性质研究。此外,Pictet Spengler反应作为与Mannich反应机理相类似的新型三组分标记反应已被成功应用于醛基化蛋白的标记中。我们推测其也可成为醛基修饰的标记策略。因此,我们设计了以2-(1H-吡咯-1-基)乙胺(AN)为探针底物的Pictet Spengler反应,并考察其与DNA醛基修饰的反应效果。我们通过HPLC分析得到AN与5f U的标记效果最优。随后,我们进行了一系列AN与5f U的反应条件尝试,以期实现两者衍生效率的考察和产物结构的鉴定。后续,我们将进一步进行AN与5f U的性质实验,并完成AN的结构化衍生。

摘要译文

关键词：

DNA醛基修饰; 脱碱基位点; 5-醛基尿嘧啶; 5-醛基胞嘧啶; 荧光探针; 定性和定量分析

学位年度：

2022

学位类型：

硕士

学科专业：

化学生物学

导师：

李坤

中图分类号：

O657.3[光化学分析法（光谱分析法）⑨];Q503[生物化学技术]

学科分类号：

070302[分析化学];070306[化学生物学];081704[应用化学];081706[分子化工];071005[生物化学与分子生物学]

D O I：

10.27342/d.cnki.gscdu.2022.002274